免疫親和柱同時(shí)凈化 HPLC 法測定植物油中黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮

鮑 蕾，呂 寧，吳振興，靜 平，許艷麗，江 帆，董 韜，果 旗，王 雄，* ，王 岳

(1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266002;2.北京中檢維康技術(shù)有限公司，北京100044;3.中國海洋大學(xué)，山東青島266100)

黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮經(jīng)常同時(shí)存在于農(nóng)作物如花生、玉米、棉籽、芝麻、核桃之中［1］，它們會(huì)發(fā)生致毒協(xié)同作用，植物油中有同時(shí)受到黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮污染的風(fēng)險(xiǎn)。中國標(biāo)準(zhǔn)［2］規(guī)定花生油、玉米油中黃曲霉毒素B1不得超過20μg/kg，其它植物油黃曲霉毒素B1不得超過10μg/kg。歐盟［3］規(guī)定毛油和精煉植物油中的黃曲霉毒素B1不得超過2μg/kg，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2總量不得超過4μg/kg，精煉玉米油中玉米赤霉烯酮不得超過200μg/kg。鮑蕾等［4］應(yīng)用免疫親和柱凈化-光化學(xué)柱后衍生-高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測器測定了植物油中的黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2，隋凱等［5］應(yīng)用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法熒光法測定了玉米中的玉米赤霉烯酮，李軍等［6］應(yīng)用免疫親和柱同時(shí)凈化-高效液相色譜法測定了谷物中的黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮。免疫親和柱作為樣品前處理的方法能有效地將干擾物質(zhì)去除。采用免疫親和柱作為樣品前處理手段，減少了有機(jī)溶劑的使用和目標(biāo)分析物的損失，具有結(jié)合容量大、回收率高、洗脫條件溫和、可以方便地重復(fù)再生使用等優(yōu)點(diǎn)。本文應(yīng)用黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮多功能親和柱(IAC-AZ)同時(shí)凈化經(jīng)90%乙腈提取的植物油樣品，然后采用高效液相色譜法熒光法分別定量檢測了黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和玉米赤霉烯酮的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、玉米赤霉烯酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線值Table 1 Calibration curve values of aflatoxin B1，B2，G1，G2 and zearalenone standard solution

IAC-AZ 免疫親和柱 北京中檢維康技術(shù)有限公司，對黃曲霉毒素的柱容量為300ng，對玉米赤霉烯酮的柱容量為1200ng;甲醇、乙腈 色譜純，美國JT BAKER 公司;1.5μm 玻璃纖維濾紙 美國VICAM公司;黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國SUPLCO 公司;花生油、玉米油、芝麻油、調(diào)和油 從青島、北京市場購得和企業(yè)贈(zèng)送。

高效液相色譜儀配熒光檢測器 型號L2000，日立公司;光化學(xué)衍生器 美國AURA INDUSTRIES 公司;多功能混合器 型號QB-206，海門市其林貝爾儀器公司;高速勻質(zhì)器 型號FSH-2，江蘇金壇榮華儀器公司。

1.2 液相色譜測定條件

測定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的液相色譜工作條件:色譜分析柱:Cloversil ODS-C18柱，5μm，4.6mm×250mm;流動(dòng)相:甲醇+ 水(45 +55，V/V);流速:1mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:25℃;熒光檢測波長:激發(fā)360nm，發(fā)射440nm。

測定玉米赤霉烯酮的液相色譜工作條件:色譜分析柱:Cloversil ODS-C18柱，5μm，4.6mm ×250mm;流動(dòng)相:乙腈+ 甲醇+ 水(46 +46 +8，V/V/V);流速:1mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:25℃;熒光檢測波長:激發(fā)274nm，發(fā)射440nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的提取 稱取5.00g 樣品于50mL 離心管中，加入25mL 提取液乙腈+水(90 +10，V/V)，用多功能旋轉(zhuǎn)混合器混合10min(或者用人工用手劇烈振蕩3min，或用高速均質(zhì)器均質(zhì)1～2min)，用中速定性濾紙過濾，收集全部濾液。

1.3.2 免疫親和柱凈化 取濾液10mL，用40mL 純水液稀釋、混勻后用玻璃纖維濾紙過濾，移取濾液20mL(相當(dāng)于0.8g 樣品)過IAC-AZ 免疫親和柱免疫親和柱，調(diào)節(jié)流速約1 ～2 滴/s，待溶液全部流出后，分別用10mL 的純水以約2～3 滴/s 清洗免疫親和柱，待溶液全部流出后。加入2mL 甲醇，調(diào)節(jié)流速約1～2 滴/s 的流速將免疫親和柱中的黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮洗脫下來。

1.3.3 液相色譜的測定 將上述洗脫液，在50℃氮?dú)庀麓蹈桑尤?.8mL 50%甲醇水溶液，混勻，注入液相色譜儀中進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.2 的液相色譜測定條件，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表1。

應(yīng)用液相色譜計(jì)算軟件，以基線噪聲10 倍峰面積對應(yīng)的峰面積對應(yīng)的五種毒素的含量作為定量限的規(guī)則(S/N =10)，得出黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量限均為0.1μg/kg，玉米赤霉烯酮的定量限為5.0μg/kg。五種毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R 均大于0.9999，結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.1～25.0ng/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系;玉米赤霉烯酮在5.0 ～200.0ng/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2 準(zhǔn)確性和重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和可靠性，對測定方法進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度測定。在空白樣品中(調(diào)和油)分別添加黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、玉米赤霉烯酮三個(gè)濃度水平，然后進(jìn)行5 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其檢測結(jié)果見表2。

從表2 中回收率及精密度數(shù)據(jù)可以看出，本方法測定黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2回收率數(shù)據(jù)全部在82.0%～91.0%之間，室內(nèi)三個(gè)水平添加五次重復(fù)的變異系數(shù)在10.4%以內(nèi)。測定玉米赤霉烯酮回收率數(shù)據(jù)在83.7%～95.5%之間，室內(nèi)三個(gè)水平添加五次重復(fù)的變異系數(shù)在7.9%以內(nèi)?；緷M足了定量檢測對回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求。

免疫親和柱的高度選擇性使樣品前處理大為簡化，本實(shí)驗(yàn)中用90%乙腈水提取，植物油中的黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，提取液用純水稀釋5 倍后，經(jīng)過免疫親和柱凈化，用水稀釋的目的是減小有機(jī)溶劑乙腈對免疫親和柱的親和力的干擾。然后用10mL 純水淋洗親和柱，去除非特異性吸附雜質(zhì)。最后用2mL 甲醇將特異性吸附的黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮洗脫到甲醇中。目標(biāo)分析物得到分離純化與富集，避免了提取液中干擾物質(zhì)HPLC 測定的影響(色譜峰中除了樣品峰和溶劑峰外，沒有其它雜峰)，凈化效果見圖1、圖2。

2.3 實(shí)際樣品的檢測結(jié)果

花生油、玉米油、芝麻油、調(diào)和油各采集5 份共20個(gè)樣本，分別進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)有三個(gè)花生油樣品黃曲霉毒素總量分別為7.9、4.5 和3.8μg/kg，有1 個(gè)芝麻油樣品中檢測出黃曲霉毒素總量含量為3.5μg/kg，花生油和芝麻油中均未檢出玉米赤霉烯酮。玉米油有2 個(gè)樣本中檢出有黃曲霉毒素，總量分別為2.7、7.8μg/kg，但所有樣本均檢出有玉米赤霉烯酮，含量為49.0～507.0μg/kg。調(diào)和油有1 個(gè)樣品中檢測出黃曲霉毒素總量含量為2.6μg/kg，3 個(gè)樣本中檢出有玉米赤霉烯酮，含量分別為10.6、27.2、49.5μg/kg。

表2 準(zhǔn)確性和重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The accuracy and repeatability of the results

圖1 花生油樣品的免疫親和柱凈化-HPLC 法檢測黃曲霉毒素的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of aflatoxins in peanut oil cleaning up by immunoaffinity column

圖2 玉米油樣品的免疫親和柱凈化-HPLC 法檢測玉米赤霉烯酮的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of zearalenone in corn oil cleaning up by immunoaffinity column

3 結(jié)論

免疫親和柱作為樣品前處理的方法是利用抗原抗體的高度特異性來進(jìn)行樣品的分離純化與富集的，因此能有效地將干擾物質(zhì)去除。采用免疫親和柱作為樣品前處理手段，減少了有機(jī)溶劑的使用和目標(biāo)分析物的損失，具有結(jié)合容量大、回收率高、洗脫條件溫和、可以方便地重復(fù)再生使用等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)很好的將免疫親和柱技術(shù)應(yīng)用到植物油中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和玉米赤霉烯酮的測定。減少了乙腈的使用，提高了樣品的凈化效果，并滿足了定量檢測對回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求。

免疫親和柱同時(shí)凈化-高效液相色譜法熒光法檢測了植物油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的方法的定量限分別為0.1μg/kg，玉米赤霉烯酮的方法的定量限分別為5.0μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10.4%，回收率為82.0%～95.5%，其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟［7］和中國［8］對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和玉米赤霉烯酮定量分析方法標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求:回收率70%～110%，CV 小于21%。該方法可以簡便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可以用于對植物油中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和玉米赤霉烯酮進(jìn)行快速定量檢測。

［1］張藝兵，鮑蕾，褚慶華.農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測分析［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006:1-42.

［2］對(EC)No 1881/2006 條例中食品中黃曲霉毒素的最大限量值的修訂［S］.歐盟(EU)條例，(EU)No 165/2010。

［3］食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量［S］.中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)，GB 2761-2011.

［4］Bao L，Trucksess MW，White KD.Determination of aflatoxins B1，B2，G1，and G2 in olive oil，peanut oil，and sesame oil［J］.J AOAC Int，2010，93(3):36-42.

［5］隋凱，李軍，衛(wèi)鋒，等.免疫親和柱-高效液相色譜法檢測玉米中的玉米赤霉烯酮［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006(6):22-23.

［6］李軍，于一茫，田苗，等.免疫親和柱凈化-柱后光化學(xué)衍生-高效液相色譜法同時(shí)檢測黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A［J］.色譜雜志，2006，24(6):581-584.

［7］Food analysis-Biotoxins-Criteria of analytical methods of mycotoxins［S］.CEN(European Committee for Standardization)，CR 13505-1999.

［8］出口商品中農(nóng)藥、獸藥殘留物及生物毒素檢驗(yàn)方法編寫的基本規(guī)定［S］.中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，SN/T 0001-1995.