薄層及凝膠色譜法測定樹莓籽原花青素的平均聚合度

張佰清，閆冬雪

( 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，遼寧沈陽110866)

隨著樹莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，樹莓籽作為樹莓產(chǎn)品的副產(chǎn)物具有很高的利用價值，其中原花青素(PC)含量高達(dá)6.81～17.6mg/g。原花青素是可以在植物中提取出來的聚多酚類混合物，屬于類黃酮類物質(zhì)，由數(shù)量不同的兒茶素和表兒茶素聚合而成［1-7］。據(jù)報道，低聚原花色素(OPCs)具有很強(qiáng)的清除自由基和抗氧化能力，還有降血脂、抗癌等多種生物活性，在北美OPCs 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)［8］。除了原花青素含量是衡量原花青素質(zhì)量的一個指標(biāo)之外，聚合度也是一個重要標(biāo)準(zhǔn)之一。由于高聚體的聚合度是難以測定的，因此我們經(jīng)常測定原花青素的平均聚合度。到現(xiàn)在為止，有文獻(xiàn)報道用高效液相和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用來測定不同聚合度的原花青素，但是這些分析手段不僅儀器昂貴，也受到對照品的限制，不適合測定所有聚合度的原花青素［9-11］。本文通過薄層色譜法將原花青素中聚合度不同的組分分離運用高效液相色譜法對其成分進(jìn)行簡單分析，并通過凝膠色譜法得到其平均聚合度，為進(jìn)一步研究樹莓籽原花青素的結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樹莓籽 遼寧今日農(nóng)業(yè)有限公司，品種為秋紅;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，葡萄籽提物 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)公司;硅膠GF254國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;SephadexLH-20 上海亞東核級樹脂有限公司;乙腈、甲醇 為色譜純;其他試劑 均為分析純;實驗用水 去離子水。

RE52-AA 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;UV-2000 紫外-可見分光光度計 Unico 上海儀器有限公司;AL204 型萬分之一天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;LD-500 搖擺式藥材粉碎機(jī) 長沙常宏藥機(jī);CR21G 高速冷凍離心機(jī) Hitachi High-Technologies Corporation;DHL-A 電腦恒流泵、HD-3 紫外檢測儀 上海滬西分析儀器廠;真空干燥箱 天津?qū)嶒瀮x器廠;Lab Workstation 2006 型高效液相色譜儀 北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法 樹莓籽用粉碎機(jī)粉碎后過篩，加入石油醚脫脂后抽濾，將樹莓籽真空干燥后加入乙醇，超聲波輔助提取樹莓籽原花青素，離心得到粗提液［1］。

1.2.2 含量測定方法 采用香草醛-鹽酸法測定原花青素含量，1mL 待測液添加入6mL 4%香草醛甲醇溶液和3mL 濃鹽酸，在避光(20℃)的條件下反應(yīng)15h 測定吸光度，計算原花青素含量［12］。

1.2.3 分離提純方法 樹莓籽原花青素粗提液經(jīng)真空濃縮后用HPD100C 大孔樹脂進(jìn)行初步的分離提純，洗脫液真空濃縮達(dá)到一定的濃度后通過薄層色譜法進(jìn)一步的分離，通過Rf 值(薄層色譜法中原點到斑點中心的距離與原點到溶劑前沿的距離的比值)判斷層析效果［13-14］。

展開溶劑的選擇:展開體系1:v(甲苯)∶v(丙酮)∶v(甲酸)=3∶6∶1;展開體系2:v(甲苯)∶v(丙酮)∶v(乙酸)=3∶4∶1;展開體系3:v(甲苯)∶v(氯仿)∶v(丙酮)=4∶2.5∶3.5;展開體系4:v(乙酸乙酯)∶v(丙酮)∶v(甲酸)∶v(水)=5∶3∶3∶1.

點樣量的選擇:配制4mg/mL 的原花青素溶液，選擇1、5、10、15、20、25μL 使用毛細(xì)管點樣，確定點樣量。

1.2.4 分析方法 將通過薄層色譜分離開的色帶刮下帶有樣品的硅膠，用甲醇洗脫，離心得上清液，真空干燥后分別將分離開的三條譜帶配制成甲醇溶液，用HPLC 進(jìn)行分析［15］。

液相色譜條件流動相:A 為2%冰醋酸;B 為乙腈∶水∶冰醋酸(80∶19.6∶0.4);檢測波長:280nm;流速:1.0 mL/min;色譜柱:反相C18柱;進(jìn)樣量:10μL。

1.2.5 平均聚合度測定方法 通過凝膠色譜法［4］進(jìn)行測定，用不同分子量的聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品以分子量為橫坐標(biāo)，保留時間為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將分離產(chǎn)物溶解后上樣于SPehadexLH-20 柱中，用8mol/L尿素-60%丙酮(4∶6)溶液以0.5mL/min 的流速進(jìn)行洗脫，每隔5min 收集一管。按照標(biāo)準(zhǔn)方程得到相對分子質(zhì)量，計算平均聚合度。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜法分離樹莓籽原花青素

2.1.1 展開劑的選擇 由表1 可以看出展開體系1、2 可以使譜帶有效分離，而展開體系3 無分離，說明溶劑的極性過小。展開體系4 譜帶無有效分離而斑點均聚集在層析板上緣，說明該展開體系的極性過大。展開體系1 雖然可以將譜帶分開，但是Rf 值比較接近，因此選擇分離效果較好的展開體系2 作為最佳展開劑。

表1 各展開體系的Rf 值Table 1 Rf of different expansion system

2.1.2 點樣量的選擇 由表2 得出，當(dāng)點樣量大于20μL 時譜帶Ⅰ、Ⅱ無法有效分離，說明已經(jīng)超載。在點樣量為15μL 時譜帶距離較近，但是仍然可以有效分離，因此選擇15μL 為最佳點樣量。

2.2 HPLC 分析分離產(chǎn)物

圖1～圖3 為經(jīng)過HPLC 分離得到的圖譜。

圖1 原花青素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC of proanthocyanidin standards

圖2 薄層譜帶Ⅰ的HPLC 圖譜Fig.2 HPLC of the TLC colour zone Ⅰ

圖3 薄層譜帶Ⅱ的HPLC 圖譜Fig.3 HPLC of the TLC colour zone Ⅱ

以上實驗得到的分析圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 圖譜比較，由圖1 看出譜帶Ⅰ是由沒食子酸、兒茶素、表兒茶素(保留時間分別為8.065、20.021、33.892min)的單體物質(zhì)構(gòu)成。由圖2 可以確定譜帶Ⅱ中的一種B2(保留時間為31.573min)。譜帶Ⅱ、Ⅲ的低聚體、高聚體組分非常復(fù)雜，還有待于進(jìn)一步研究。

2.3 平均聚合度的測定

由于對原花青素高聚體的定性和定量是比較困難的，因此測定平均聚合度成為分析原花青素常用的方法。凝膠滲透色譜實際上是一種分子排阻色譜，研究發(fā)現(xiàn)可以采用此方法測定原花青素的聚合度。

由實驗結(jié)果，根據(jù)聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫曲線和分子排阻方程以分子量為橫坐標(biāo)，時間為縱坐標(biāo)建立二者的相關(guān)方程，如圖4 所示。

圖4 薄層譜帶Ⅲ的HPLC 圖譜Fig.4 HPLC of the TLC colour zone Ⅲ

圖5 為薄層分離得到的三條譜帶的凝膠色譜圖，由圖中各譜帶的保留時間，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出譜帶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均分子量分別為269，714 和1375。由HPLC 知譜帶Ⅰ主要為兒茶素和表兒茶素為單體成分的物質(zhì)，因此可推算出Ⅱ、Ⅲ的平均聚合度分別為2.65 和5.11。同時在凝膠色譜圖中看到，三個譜帶的洗脫圖形有所不同。譜帶Ⅰ圖形比較尖銳，說明其分子構(gòu)成簡單。但譜帶Ⅲ的曲線拖尾現(xiàn)象十分明顯，這種拖尾現(xiàn)象可能是其產(chǎn)物構(gòu)成較為復(fù)雜和多樣，也可能是由于分級洗脫不夠徹底造成的。

圖5 聚苯乙烯分子量與保留時間的關(guān)系Fig.5 The coreralationship between molecular weight of polystyrene and retention time

3 結(jié)論

實驗表明，展開劑為v(甲苯)∶v(丙酮)∶v(乙酸)=3∶4∶1，樣品濃度4mg/mL，點樣量15μL 時，薄層色譜對樹莓籽原花青素分離效果最佳。HPLC 譜帶分析表明樹莓籽原花青素為多聚體混合物，通過凝膠色譜法測定三條譜帶的平均聚合度，得出譜帶Ⅰ單體物質(zhì)為1，可以確定其組分包括沒食子酸、兒茶素、表兒茶素，譜帶Ⅱ中包括一種二聚體，平均聚合度為2.65，譜帶Ⅲ的組分最為復(fù)雜，平均聚合度為5.11。由于各種異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)、種類非常復(fù)雜，各組分出峰有待進(jìn)一步探討。

圖6 各譜帶的凝膠色譜圖Fig.6 The chromatogram of Sephadex LH-20 gel permeation chromatography

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