高密度CO2對生鮮調(diào)理雞肉殺菌動力學模型構(gòu)建

饒偉麗，劉 琳，張德權(quán)，楊 揚，王振宇，陳 麗，高 遠

(中國農(nóng)業(yè)科學研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，北京100193)

高密度CO2殺菌技術是近年來發(fā)展起來的一種新型非熱力殺菌技術，由于其具有殺菌溫度低、無殘留、無污染、營養(yǎng)損失少等優(yōu)點，受到國內(nèi)外學者的廣泛關注，研究日益增多。目前，高密度CO2的研究主要集中在對果汁、牛奶等液態(tài)食品中微生物和酶的影響，以固態(tài)食品為處理介質(zhì)的研究很少［1］。同時，微生物殺滅效果的數(shù)學模型是研究殺菌技術的理論關鍵之一，對其實際應用具有理論指導作用。目前有關肉品中高密度CO2殺菌的數(shù)學模型尚不清楚，因此尋找一個可靠的數(shù)學模型來精確描述不同處理條件下高密度CO2處理后肉品中微生物失活動力學變化是高密度CO2殺菌技術的研究熱點之一。一級動力學模型是較為常用的殺菌模型之一，描述了微生物殘存率數(shù)量級和處理時間的線性關系。但國外有研究表明高密度CO2殺菌后微生物存活曲線并不符合一級動力學模型，呈現(xiàn)出倒“S”形［1－4］。非線性模型較多，如Weibull模型、Modified Gompertz模型、Logistic 模型等，Kim 等人［4］首次將 Modified Gompertz模型應用于高密度CO2殺菌中，發(fā)現(xiàn)此模型很好地擬合了高密度CO2處理下，大腸桿菌和沙門氏菌的失活曲線。Weibull、Modified Gompertz、Logistic模型能否較好地表示不同處理條件下高密度CO2作用后微生物失活動力學變化目前尚缺乏足夠的證據(jù)予以證實。同時，高密度CO2對固體食品，尤其是調(diào)理肉制品的殺菌效果和殺菌動力學的研究尚未見報道。為此，本實驗以生鮮調(diào)理雞肉為殺菌對象，研究不同壓力、溫度和時間下高密度CO2對細菌的滅活效果，采用 Weibull、Modified Gompertz、Logistic三個模型分析高密度CO2作用下微生物失活動力學變化，并通過模型分析參數(shù) Af、Bf、SS、RMSE、R2評價模型的擬合程度，旨在找出最能擬合高密度CO2處理下微生物失活曲線的數(shù)學模型，為高密度CO2殺菌的實際應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胸肉 市售;培養(yǎng)基 北京陸橋科技有限公司;二氧化碳(純度為99.95%)北京氧氣廠。

高密度CO2裝置 美國ISCO公司;LDZX－40B2型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HH.B11420型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;WH－2微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠;BG－easy PZPETS1000移液器 北京百晶生物技術有限公司;DT－100A電子分析天平唐山光學儀器廠;SC－279GA海爾冰箱 青島海爾特種冰柜有限公司;裝配式潔凈室 北京翌華月凈化技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備生鮮調(diào)理雞肉 配方(按100g雞胸肉計算):食鹽 2g、味精 0.5g、白糖 2g、淀粉 5g。

工藝流程:新鮮雞胸肉→清洗→切塊→添加輔料并調(diào)制→生鮮調(diào)理雞肉。

1.2.2 高密度CO2處理 高密度CO2處理壓力分別為 10、30、50MPa;溫度分別為 35、40、45、50、55℃;時間分別為 15、30、45、60、75min。高密度 CO2處理操作如下:無菌狀態(tài)下，將生鮮調(diào)理雞肉放入5mL的無菌離心管中。待高密度CO2裝置預熱到設定溫度后，將離心管置于殺菌釜中。經(jīng)一定時間的升壓過程達到設定壓力，生鮮調(diào)理雞肉在恒定溫度和壓力下進行靜態(tài)處理。處理結(jié)束后卸壓，取出離心管用無菌袋封裝，迅速放入冰箱內(nèi)，常溫下檢測其菌落總數(shù)。高密度CO2裝置每次使用前都用75%的酒精和無菌水循環(huán)清洗5min。

1.2.3 菌落總數(shù)測定 按《GB/T 4789.17－2003食品衛(wèi)生微生物學檢驗 肉與肉制品檢驗》［5］標準進行測定。殺菌效果以細菌存活率對數(shù)值lg(N/No)表示，其中N為高密度CO2處理后樣品的菌落總數(shù)，cfu/g;No為高密度CO2處理前樣品的菌落總數(shù)，cfu/g。

1.2.4 D值 D值是在一定溫度下，活菌(或芽孢)數(shù)的90%死亡所需要的時間。即細菌殘存曲線橫過一個對數(shù)周期所需的時間，數(shù)值上等于細菌致死殘存曲線斜率的負數(shù)，是表示微生物死亡速率的一種方法。計算公式如下:

式中:N－時刻 t時的菌數(shù)，cfu/g;t－時間，min;N0－初始菌數(shù)，cfu/g。

1.2.5 微生物殺菌動力學模型

1.2.5.1 Weibull模型 此模型是由 Weibull等［6］提出，此模型假設菌體間的熱抗性和耐壓性有差別，存活曲線符合累積分布函數(shù)。Weibull模型的公式如下:

式中:a為比例因子(scale factor)，b為形狀因子(shape factor)。

1.2.5.2 Modified Gompertz模型 此模型是由Zwietering 等［7］提出，根據(jù) S R Kim 等［3－4］研究得到以下公式:

式中:A為高低漸近線之差;kdm為最大滅活速率，min－1;λ 為延遲期時間，min;t為處理時間，min。

1.2.5.3 Logistic模型 此模型是 Cole等［8］提出，最初是用于研究熱處理條件下微生物營養(yǎng)體細胞和芽孢菌的失活［9－10］，其擬合是基于微生物對外界處理條件的敏感性不同。公式如下:

式中:α為上漸近線(upper asymptote)，lg(cfu/g);ω為下漸近線(lower asymptote)，lg(cfu/g);σ為失活曲線的最大斜率(maximum slope of the inactivation curve);τ為失活曲線達到最大斜率時的數(shù)量級時間(log time at which the maximum slope is reached)，lg(min)，決定曲線的位置;t為處理時間，min。

1.2.5.4 模型評價 采用 Af、Bf、SS、RMSE 和 R2五個參數(shù)評價模型評判擬合度的優(yōu)劣［11－14］。Af是精確因子，表示預測值與實測值偏離程度;Bf是偏差因子，Bf＞1表示模型預測值比實測值高，Bf＜1表示模型預測值比實測值低;SS是根平方和;RMSE是根平均方差;R2是相關系數(shù)。Af和Bf表示模型的性能，Af值越小，Bf值越接近1，模型擬合度越高;SS表示模型的精確度，SS越小，模型精確度越高，擬合度越好;相關系數(shù) R2和 RMS E 表示模型的可靠度［13，16］，R2越大，RMSE越小，模型擬合度越高。Af、Bf和RMSE公式如下:

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Excel和Origin 8.0分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高密度CO2對生鮮調(diào)理雞肉的殺菌效果

2.1.1 不同壓力對高密度CO2殺菌效果的影響 由圖1可知:常壓熱處理對生鮮調(diào)理雞肉中細菌的殺菌效果不明顯，55℃、75min處理，菌落總數(shù)僅下降0.859個對數(shù);高壓CO2和熱處理結(jié)合可明顯增強殺菌效果，且隨處理壓力和時間的增加，殺菌效果逐漸增強;不同處理壓力間殺菌效果差異顯著(p＜0.05)。高密度CO2處理后細菌存活率的降低呈現(xiàn)慢→快→慢的變化趨勢，表明CO2在生鮮調(diào)理雞肉的水相中溶解以及進入細胞擴散需要一段時間;此后隨著處理壓力和時間的增加，CO2與水相間的傳質(zhì)速率和溶解度提高，CO2可以快速地進入水相，并在水相中具有較高濃度的CO2而打破了微生物細胞內(nèi)的生理平衡，同時高密度CO2易將微生物胞內(nèi)物質(zhì)萃出而造成細胞迅速死亡［2］。生鮮調(diào)理雞肉中細菌種類繁多，每種微生物對高密度CO2的敏感性不同，如革蘭氏陰性菌對高密度CO2敏感程度強于革蘭氏陽性菌［1］，因此在殺菌初期一些不耐高壓 CO2的微生物迅速死亡，而殘存下來的微生物對高壓CO2均具有較強的抗性，不易被殺滅，致使滅活速率降低。Lin等指出食品中的蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)能降低高密度CO2的透過能力，使CO2無法進入細胞內(nèi)，從而降低了高密度CO2對微生物的滅活效果［17］，所以生鮮調(diào)理雞肉中的蛋白質(zhì)、脂肪等對微生物的失活也起了一定的保護作用，并且隨著處理時間的延長，這種保護作用愈加明顯。此外，隨著細胞內(nèi)外液pH、細胞構(gòu)造、酶和細胞內(nèi)其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)化等眾多因素影響，致使在高密度CO2殺菌后期細菌滅活速率降低。

2.1.2 不同溫度對高密度CO2殺菌效果的影響 由圖2可知:隨處理溫度和時間的增加，高密度CO2對生鮮調(diào)理雞肉中細菌的殺菌效果逐漸增強;不同處理溫度間殺菌效果差異顯著(p＜0.05)。在處理壓力和時間一定時，溫度越高，殺菌效果越好，這是因為溫度的升高增加了CO2的擴散速率以及細胞膜的流動性，使CO2更易透過，從而加速了細菌的死亡［18］。處理時間為15～30min時，45℃的殺菌效果比40℃的殺菌效果差，這可能是因為生鮮調(diào)理雞肉中細菌種類繁多，每種細菌之間的抗熱性和耐壓性存在差異，其原因有待深入研究。

2.2 不同壓力和溫度對高密度CO2殺菌D值的影響

由圖3可知:同一溫度下，高壓CO2殺菌D值均小于常壓(0.1MPa)下熱殺菌D值，表明高壓CO2和熱處理結(jié)合殺菌效果更好，這與圖1相吻合。相同溫度下，高密度CO2壓力越大，其殺菌D值越小，表明壓力升高，高壓CO2對細菌的滅活效果增強。相同壓力下，溫度越高，D值越小，表明溫度升高，CO2對細菌的滅活效果增強?？傊?，隨著壓力和溫度的增加，高密度CO2的殺菌效果逐步增強，這與圖1～圖2相吻合。

2.3 三種模型分析

由表1中的數(shù)據(jù)可知:不同高密度CO2處理條件下，Weibull模型擬合值的相關系數(shù)R2在0.891以上，大多數(shù)在0.907～0.978之間，表明此模型較好地擬合了生鮮調(diào)理雞肉中細菌的失活曲線。隨著處理壓力和溫度的增加，比例因子a從69.635min下降到0.925min，形狀因子b從2.073下降到0.346。a因子通常認為是速度常數(shù)，b因子通常代表失活曲線的形狀，當b＜1時失活曲線是凹面，b＞1時失活曲線是凸面，當b=1時失活曲線是一條直線，即一級動力學反應［19］。本實驗數(shù)據(jù)表明高密度CO2處理生鮮調(diào)理雞肉中細菌的失活曲線既有凹面也由凸面，這與圖1吻合，這可能是因為生鮮調(diào)理雞肉中細菌的種類繁多，每種細菌之間的抗熱性和耐壓性存在差異，其原因有待深入研究。

圖1 不同壓力對高密度CO2殺菌效果的影響Fig.1 Effect of the different pressure on the inactivation of dense phase CO2

Modified Gompertz模型擬合值的相關系數(shù)R2在0.884以上，大多數(shù)在0.918～0.994之間，表明此模型很好地擬合了生鮮調(diào)理雞肉中細菌的失活曲線。

Logistic模型擬合值的決定系數(shù)R2在0.959以上，表明此模型同樣很好地擬合了調(diào)理雞肉中細菌的失活曲線。

圖2 不同溫度對高密度CO2殺菌效果的影響Fig.2 Effect of the different temperature on the inactivation of dense phase CO2

圖3 不同壓力和溫度對高密度CO2殺菌D值的影響Fig.3 Effect of the dense phase CO2pressure and temperature on the D value

2.4 三種模型評價

表2中的數(shù)據(jù)表明:Logistic模型的Af、SS分別為 1.038、0.761小于 Weibull模型和 Modified Gompertz模型得到的相應參數(shù)值;Log－logistic模型實測值和模型值相關系數(shù)R2為0.999大于Weibull模型和 Modified Gompertz模型的決定系數(shù);Loglogistic模型的偏差因子Bf等于1.005，更加接近1。因此，3個模型中Logisti模型最好地擬合了生鮮調(diào)理雞肉中細菌的失活曲線。Weibull模型和Modified Gompertz模型比較而言，Modified Gompertz模型的Af、SS較小，相關系數(shù) R2較大，整體而言，Modified Gompertz模型比Weibull模型更好地擬合了生鮮調(diào)理雞肉中細菌的失活曲線。

由圖4可知:Weibull模型、Modified Gompertz模型、Log－logistic模型對高密度CO2殺滅生鮮調(diào)理雞肉中細菌的預測值和實測值之間有較好相關性，決定系數(shù) R2分別為0.980、0.992、0.999，擬合得到的方程分別為 y= －0.104+0.959x、y=0.005+0.999x、y=－0.002+0.999x。模型預測值與實測值越接近，則擬合直線的方程的斜率越接近于1，且方程截距越趨向于0。因此，根據(jù)決定系數(shù)R2，Log－logistic模型的擬合度最好，其次為Modified Gompertz模型，Weibull模型最差，這與表2數(shù)據(jù)吻合。

圖4 高密度CO2殺菌效果預測值和實測值的相關性Fig.4 Correlation between the observed values and predicted values for inactivation effects of the dense phase CO2

表1 三種模型擬合高密度CO2殺菌效果的動力學曲線參數(shù)Table 1 Parameters of inactivation kinetics curves fitting by three models for total bacteria count treated by dense phase CO2

表2 三種模型評價參數(shù)比較Table 2 Comparison of the evaluation parameters of three models

3 結(jié)論

在本研究中，隨處理壓力、溫度和時間的增加，高密度CO2對生鮮調(diào)理雞肉中細菌的殺菌效果逐漸增強。預測值和實測值的相關決定系數(shù)R2表明，Weibull模型、Modified Gompertz模型、Log－logistic模型都能較好的擬合生鮮調(diào)理雞肉中細菌的失活曲線，其中 Log－logistic模型擬合度最好，其次為Modified Gompertz模型，再次為Weibull模型。

［1］Garcia－Gonzalez L，Elst K，Spilimbergo S，et al.High pressure carbon dioxide inactivation of microorganisms in foods:The past，the present and the future［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，117:1－28.

［2］Spilimbergo S，Bertucco A.Non－thermal Bacteria inactivation with dense CO2［J］.Biotechnology and Bioenginerring，2003，84:628－636.

［3］Kim SR，Rhee MS，Kim BC，et al.Modeling the inactivation of Escherichia coli O157∶H7 and generic Escherichia coli by supercritical carbon dioxide［J］.Food Microbiology，2007，118:52－61.

［4］Kim SR，Rhee MS，Kim BC，et al.Modeling of the inactivation of Salmonella typhimurium by supercritical carbon dioxide in physiological saline and phosphate－ buffered saline［J］.Microbiological Methods，2007，70:132－141.

［5］中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所.GB/T 4789.17－2003.中國標準書號［S］.北京:中國標準出版社，2003.

［6］WeibullW.A statisticaldistribution function ofwide applicability［J］.Applied Mechanics，1951，51:293－297.

［7］Zwietering M H，Jongenburger I，Rombouts FM，et al.Modeling of the bacterial－ growth curve［J］.Applied and Environmental Microbiology，1990，56(6):1875－1881.

［8］Cole M B，Davies K W，Munro G，et al.A Vitalistic model to describe the thermal inactivation of Listeria monocytogenes［J］.Industrial Microbiology，1993(12):232－239.

［9］Ellison A，Anderson W，Cole M B，et al.Modelling the thermal inactivation of Salmonella typ－h(huán)imurium using biolum inescence data［J］.Food Microbiology，1994(3):243－251.

［10］Anderson W A，Mcclure P J，Baird－Parker A C，et al.The application of a log－logistic to describe the thermal inactivation of Clostridium botulinum 213B at temperature below 121.1℃［J］.Applied Bacteriology，1996，80(3):283－290.

［11］鐘葵，吳繼紅，廖小軍，等.高壓脈沖電場對植物乳桿菌的殺菌效果及三種模型的比較分析［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2006，22(11):238－243.

［12］álvarez I，Virto R，Raso J，et al.Comparing predicting models for the Escherichia coli inactivation by pulsed electric fields［J］.Food Science and Technology，2003，4:195－202.

［13］Ross T.Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology［J］.Applied Bacteriology，1996，81(5):501－508.

［14］Chen Haiqiang.Use of linear，Weibull，and log－ logistic functions to model pressure inactivation of seven foodborne pathogens in milk［J］.Food Microbiology，2007，24:197－204.

［15］Mcclure P J，Baranyi J，Boogard E，et al.A predictive model for the combined effect of pH，sodium chloride and storage temperature on the growth of Brocothrix thermosphacta ［J］.Food Microbiology，1993，19:161－178.

［16］Duh Y H，Schaffer N W.Modelling the effect of temperature on the growth rate and lag time of Listeria innocula and Listeria monocyto genes［J］.Food Protection，1993，56:205－210.

［17］Lin H M，Cao N J，Chen L F.Antimicrobial effect of pressurized carbon dioxide on Listeria monocytogenes［J］.Food Science，1994，59:657－659.

［18］Shimoda M，Kago H，Kojima N，et al.Accelerated death kineticsofAspergillus niger Spores under high pressure carbonation［J］.Applied and Environmental Microbiology，2002，8:4162－4167.

［19］Rodrigo D，Ruíz P，Barbosa－ Cánovas G V，et al.Kinetic model for the inactivation of L－actobacllus plantarum by pulsed electric fields［J］.Food Microbiology，2003，81:223－229.