響應(yīng)面法優(yōu)化里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵培養(yǎng)基

黃 瑞，張 超，李小娟，田 輝，趙儒銘，龔大春

( 三峽大學(xué)新能源研究院生物質(zhì)能研究所，湖北宜昌443002)

現(xiàn)代化工業(yè)的快速發(fā)展使得能源短缺問題日益嚴(yán)重，尋找新的能源已是當(dāng)務(wù)之急。植物纖維是地球上取之不盡的生物能源，可將其轉(zhuǎn)化為乙醇，作為工業(yè)生產(chǎn)直接用能，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，并可減少環(huán)境污染，促進(jìn)自然界碳素循環(huán)。據(jù)報(bào)道，木聚糖酶在與其他酶的協(xié)同作用下可將植物纖維降解為戊糖和己糖，以戊糖和己糖為發(fā)酵底物，通過微生物作用可生產(chǎn)乙醇［1］。廣義的木聚糖酶是指能夠降解半纖維素木聚糖的一組酶的總稱，降解時(shí)起主要作用的是內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶［2-3］，完全降解還需α-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、酚酸酯酶等的參與［4］。木聚糖酶作為酶制劑行業(yè)中的一個(gè)重要產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于食品、造紙、飲料、紡織業(yè)及廢物處理［5］。已發(fā)現(xiàn)的木聚糖酶種類繁多而且廣泛存在于海洋及陸地，但因?yàn)楂@得難易程度及純度的原因，當(dāng)前商用木聚糖酶仍主要依靠微生物發(fā)酵獲得［6］。因此，開展對(duì)木聚糖酶發(fā)酵工藝的研究，進(jìn)行里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基成分及中試放大研究，可以為木聚糖酶的生產(chǎn)研究提供重要的理論依據(jù)，為清潔能源的開發(fā)提供有力保障。響應(yīng)面分析法包括了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立模型，分析模型合理性和尋求最優(yōu)解等眾多實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)技術(shù)，采用該法可以建立連續(xù)變量曲面模型，以最經(jīng)濟(jì)的方式對(duì)所選的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面研究，對(duì)影響生物過程的因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化與評(píng)價(jià)［7-12］。以往關(guān)于里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的研究方法比較單一，主要為單因素法和正交法。如毛連山等［13］用單因素法確定了里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基成分，并確定了最佳碳氮比7.2;魏瑛等［14］利用正交法確定了最佳培養(yǎng)基組成為牛肉膏、蛋白胨、玉米芯、葡萄糖，其比例為1∶0.50∶3∶0.43。而單因素法和正交法均存在局限性，單因素法無法得知因素間的交互影響，正交法只能得到最佳因素水平的組合。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Design-Expert7.0 軟件中的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)法、Behnken-Box 設(shè)計(jì)法以及最陡爬坡路徑法對(duì)里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，并利用minitab16 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，為其中試放大提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

里氏木霉(Trichoderma reesei) 艾倫麥克德爾米德研究所提供;木聚糖 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;其他試劑 國產(chǎn)分析純。

BPC-250F 型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;UV-1100 型紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;XFLS-50MA 型滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;SW-CT-1D 型凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;AR2140 型分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ZHWY-1102 型恒溫培養(yǎng)震蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的配制

1.2.1 斜面培養(yǎng)基PDA 培養(yǎng)基。

1.2.2 種子培養(yǎng)基 木糖20g/L、玉米漿17g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、無水CaCl20.4g/L。

1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 乳糖30g/L、玉米漿17g/L、(NH4)2SO45g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、無水CaCl20.4g/L、吐溫-80 2mL/L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子液制備 取28℃下培養(yǎng)成熟的斜面試管一支，用無菌生理鹽水沖洗，適當(dāng)稀釋，配制成108cfu/mL 的孢子懸浮液，以10%的接種量接入裝有100mL 種子液的250mL 錐形瓶中，28℃、200r/min 下培養(yǎng)48h。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基250mL 搖瓶裝液量50mL，以10%的接種量接種，28℃、200r/min下培養(yǎng)72h。

1.3.3 酶活的測定 采用紫外分光光度法:a.實(shí)驗(yàn)組，向50℃中預(yù)熱3min 的底物(質(zhì)量濃度為10mg/mL的木聚糖溶液2mL)加入2mL 經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液，50℃保溫15min 后加入5mL DNS 溶液，電磁震蕩3～5s，以終止反應(yīng)。沸水浴加熱10min，用自來水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25mL，電磁震蕩3～5s，在540nm 處測定吸光度值A(chǔ)E;b.對(duì)照組，向保溫3min 的底物中加入已滅活的酶液2mL，50℃保溫15min 后加入5mL DNS 溶液。沸水浴加熱10min，用自來水冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25mL，電磁震蕩3～5s，在540nm 處測定吸光度值A(chǔ)B。酶活定義:在50℃，pH5.5 的條件下，每分鐘從10mg/mL 的木聚糖溶液中降解釋放1μmol 還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U。

式中:K-標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;C0-標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距;M-木糖的摩爾質(zhì)量，M(C5H10O5)=150.2g/mol;t-酶解反應(yīng)時(shí)間，min;1000 - 轉(zhuǎn)化因子，1mmol =1000μmol;Df-酶液稀釋倍數(shù)。

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)法篩選影響酶活的顯著性影響因素PB 法是一種近飽和的2 水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。它基于非完全平衡塊原理，能用最少實(shí)驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng)，以從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素供進(jìn)一步研究［15］。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用N =7 的Plackett-Burman 設(shè)計(jì)表對(duì)培養(yǎng)基的7 個(gè)組分的重要性進(jìn)行研究，以3 組零點(diǎn)值估計(jì)誤差。PB 設(shè)計(jì)表見表1。

表1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)各因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面只有在臨近最佳值時(shí)才能建立有效的響應(yīng)面方程。最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域［16］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)1.4.1 的結(jié)果，做最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 Box-Behnken 設(shè)計(jì) 以爬坡設(shè)計(jì)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行Box-Behnken 設(shè)計(jì)，因素與水平見表2，用軟件Design expert 7.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行回歸分析，利用軟件minitab16 進(jìn)行誤差分析并求得最優(yōu)值，得出響應(yīng)面分析結(jié)果，進(jìn)而確定最佳培養(yǎng)條件，最后依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面立體分析圖。

1.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 用所得到的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值，以驗(yàn)證模型是否可靠，進(jìn)而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，回歸分析結(jié)果見表4。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)各因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

該模型R2=0.9137，說明91.37%的數(shù)據(jù)可用此模型解釋。模型p 值(prob ＞F)=0.0079 ＜0.05，表明此模型顯著，可在0.05 水平上擬合數(shù)據(jù)。失擬項(xiàng)p值(prob ＞F)=0.1008 ＞0.1，表明失擬項(xiàng)不顯著，模型沒有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象。由各因素的p 值可看出，對(duì)產(chǎn)酶影響最顯著的3 個(gè)因素依次為:A ＞B ＞D，即乳糖＞玉米漿＞KH2PO4。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)這3 個(gè)因素作進(jìn)一步研究。

表3 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and result of Plackett-Burman

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表4 中A、B、D 3 個(gè)因素估計(jì)系數(shù)的正負(fù)效應(yīng)，依次增大或減小，乳糖和KH2PO4是正效應(yīng)，應(yīng)依次增大;玉米漿是負(fù)效應(yīng)，應(yīng)依次減小;其他非顯著性因素根據(jù)表4 中的估計(jì)系數(shù)的正負(fù)取PB 設(shè)計(jì)中的最大值或最小值，(NH4)2SO43g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，無水CaCl20.6g/L，吐溫-80 1mL/L。爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表4 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)回歸分析Table 4 Regression analysis of Plackett-Burman design

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Result of steepest ascent experiment

結(jié)果表明，隨著乳糖和KH2PO4濃度逐漸增大，玉米漿濃度逐漸減小，酶活呈現(xiàn)先增大后減小的變化。當(dāng)乳糖為40g/L，玉米漿為15g/L，KH2PO4為3g/L 時(shí)，酶活達(dá)到最大。因此以實(shí)驗(yàn)號(hào)2 各因素水平為中心值設(shè)計(jì)后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

Box-Behnken 設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表6、表7。

表6 Box-Behnken 設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and result of Box-Behnken

表7 Box-Behnken 設(shè)計(jì)回歸分析Table 7 Regression analysis of Box-Behnken design

該二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2=0.9458，表明僅有5.42%的變異不能由此模型解釋;模型p 值(prob＞F)= 0.0111 表明模型是顯著的，失擬項(xiàng)p 值為0.0706 表明失擬項(xiàng)不顯著，模型沒有失擬現(xiàn)象。A(乳糖)，B(玉米漿)對(duì)酶活的影響顯著，D(KH2PO4)次之;AB 的交互影響顯著，AD，BD 的交互影響不顯著;A2，B2，D2對(duì)酶活的影響均顯著。殘差概率分布圖(圖1)中的點(diǎn)在同一直線上，殘差與擬合值圖(圖2)中的點(diǎn)分布無規(guī)律，認(rèn)可誤差服從正態(tài)。

圖1 殘差概率分布圖Fig.1 Residual probability distribution

圖2 殘差與擬合值圖Fig.2 Residuals and fitted values

圖3 minitab16 優(yōu)化器優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization results of minitab16 optimizer

通過二次模型回歸系數(shù)的計(jì)算，得到如下方程以表征3 個(gè)因素對(duì)木聚糖酶活力的影響:

式中，R 代表木聚糖酶的酶活力(U/mL)，A、B、D 分別代表乳糖、玉米漿和KH2PO4的實(shí)際質(zhì)量濃度值。利用minitab16 中的響應(yīng)優(yōu)化器解得最優(yōu)值點(diǎn)為A =45.13，B =15.94，D =2.73，即質(zhì)量濃度分別為乳糖45.13g/L，玉米漿15.94g/L，KH2PO42.73g/L，預(yù)測最大酶活855.01U/mL(圖3)。根據(jù)上述擬合回歸方程作響應(yīng)面分析圖，圖4 中當(dāng)固定KH2PO42.73g/L時(shí)，乳糖從30g/L 增大至50g/L，玉米漿從13g/L 增大至17g/L 的過程中，木聚糖酶酶活力均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，曲面的頂點(diǎn)即為酶活最大值點(diǎn)，其對(duì)應(yīng)的乳糖濃度為45.13g/L，玉米漿濃度為15.94g/L。同理，圖5 和圖6 中的曲面分別反映了乳糖和KH2PO4、玉米漿和KH2PO4的交互作用。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用上述步驟得出的最佳培養(yǎng)基配方:乳糖45.13g/L，玉米漿15.94g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO42.73g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，無水CaCl20.6g/L，吐溫-80 1mL/L，做5 組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表8 所示:

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 8 Verification experiment

圖4 乳糖和玉米漿的交互作用對(duì)木聚糖酶酶活影響的響應(yīng)面圖(KH2PO4 2.73g/L)Fig.4 Response surface for interaction effects of lactose and corn syrup on xylanase activity(KH2PO4 2.73g/L)

圖5 乳糖和KH2PO4 的交互作用對(duì)木聚糖酶酶活影響的響應(yīng)面圖(玉米漿15.94g/L)Fig.5 Response surface for interaction effects of lactose and KH2PO4 on xylanase activity(corn syrup 15.94g/L)

圖6 玉米漿和KH2PO4 的交互作用對(duì)木聚糖酶酶活影響的響應(yīng)面圖(乳糖45.13g/L)Fig.6 Response surface for interaction effects of corn syrup and KH2PO4 on xylanase activity(lactose 45.13g/L)

實(shí)驗(yàn)值(847.112 ±5.359)U/mL 與預(yù)測值接近，表明模型具有良好的擬合性。

3 結(jié)論

本研究通過Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，快速有效地從7 個(gè)影響產(chǎn)木聚糖酶的因素中篩選出3 個(gè)顯著性影響因素:乳糖、玉米漿和KH2PO4，然后利用最陡爬坡法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域并用Box-Behnken 設(shè)計(jì)得出最佳培養(yǎng)基濃度組合:乳糖45.13g/L，玉米漿15.94g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO42.73g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，無水CaCl20.6g/L，吐溫-80 1mL/L。在最佳培養(yǎng)基組合下，木聚糖酶實(shí)際酶活力達(dá)到847.112U/mL，與理論最大酶活力855.01U/mL 接近，說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶是合理可靠的。經(jīng)優(yōu)化，酶活力比優(yōu)化前提高了24.1%。

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