大豆磷脂對(duì)大豆蛋白乳化體系的影響

李 楊，王 妍，張雅娜，王 辰，王 歡，江連洲 ，劉海英，馮 丹，王中江

( 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

大豆分離蛋白不僅具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，還表現(xiàn)出良好的加工特性，如乳化性、凝膠性、溶解性、起泡性等，這些加工特性在食品加工中起著重要作用［1］。蛋白質(zhì)的乳化性是大豆蛋白的一個(gè)非常重要的物理性質(zhì)，其既能降低水和油的表面張力，又能降低水和空氣的表面張力，因此易于形成穩(wěn)定的乳化液［2］。大豆磷脂是一種天然食品添加劑，在烘焙食品、糖果、人造奶油、速溶食品及面制品中得到廣泛應(yīng)用。磷脂添加于食品中，不僅起乳化、潤濕、起酥、防止老化及抗氧化作用，而且還能與谷物淀粉、蛋白質(zhì)相結(jié)合，改善食品的質(zhì)地結(jié)構(gòu)，對(duì)食品起營養(yǎng)強(qiáng)化作用。由于大豆蛋白質(zhì)與磷脂均具有良好的乳化性能，使傳統(tǒng)豆制品如豆腐、豆奶、豆?jié){等在加工中極易形成乳化體系，乳化體系界面特征直接關(guān)系到產(chǎn)品口感、貨架期、應(yīng)用等。研究表明大豆蛋白質(zhì)與磷脂之間存在交互作用，這種交互作用對(duì)乳化體系結(jié)構(gòu)有一定影響［3］，而目前關(guān)于蛋白質(zhì)與磷脂的交互作用機(jī)理尚不清楚，進(jìn)而限制后續(xù)關(guān)于大豆蛋白-磷脂共建乳化體系的研究，致使乳化體系在傳統(tǒng)豆制品加工及貯藏中難以調(diào)控。目前某些企業(yè)和小作坊違法使用劣質(zhì)乳化劑、超量使用食品乳化劑的現(xiàn)象屢有發(fā)生，這些都使豆制品的質(zhì)量安全存在較大隱患。大豆蛋白、磷脂作為安全、無毒副作用并具有治療與保健功能的天然食品乳化劑日益受到青睞。目前市場上興起的卵磷脂豆奶、磷脂饅頭、大豆磷脂冰激凌等備受消費(fèi)者喜愛，蛋白質(zhì)及磷脂的加入不僅增強(qiáng)食品營養(yǎng)性，而且提高食品乳化體系的穩(wěn)定性，因此，對(duì)解決傳統(tǒng)豆制品中乳化問題有重要意義。本實(shí)驗(yàn)從大豆分離蛋白主要組分入手，分離純化出大豆分離蛋白及其主要組分7S 及11S 球蛋白，考察磷脂的加入對(duì)三種球蛋白形成乳狀液的影響，并探討了相關(guān)作用機(jī)理，為研究大豆蛋白與磷脂交互作用對(duì)乳化體系形成的影響機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂豆粕 哈高科;大豆磷脂 深圳康之源生物有限公司;金龍魚大豆調(diào)和油 超市購買;SDS、磷酸鹽 分析純。

pHS-25 型酸度計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠;電子分析天平 梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司;T18 basic 高速乳化均質(zhì)機(jī) 英國IKA 公司;722S 分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;微量取樣器上海榮泰生化工程有限公司;磁力攪拌器、機(jī)械攪拌器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;流變儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備 采用Molina Ortiz 等的方法［4］。脫脂大豆粉→攪拌( 料液比1 ∶20，提取時(shí)間2h，25℃) →離心→上清液(2mol/L HCl 調(diào)至pH 4.5 在4℃靜置2h) →離心20min(400 ×g) →沉淀( 復(fù)溶于5 倍蒸餾水) →冷凍干燥→SPI

1.2.2 7S 和11S 的提取 7S 和11S 的提取參考Nagano 的實(shí)驗(yàn)方法［10］。脫脂豆粉→提取(15 倍水，2mol/L NaoH 調(diào)pH7.5，室溫提取1h) →離心(9000 ×g 20min) →上清液→加NaHSO3，2mol/L HCl 調(diào)至pH6.4，4℃過夜→離心(6500 ×g，20min，4℃) →沉淀(11S) →上清液→用NaCl 調(diào)離子濃度0.25mol/L，2mol/L HCl 調(diào)pH 至5.0，靜置1h→離心9000 ×g，30min，4℃) →上清液→用水稀釋兩倍，2mol/L HCl調(diào)至pH4.8→離心(6500 ×g，20min，4℃) →沉淀(7S)

1.2.3 7S/11S 的確定 采用不連續(xù)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法［5］，濃縮膠和分離膠中SDS 濃度為0.1%、過硫酸銨濃度為0.075%、四甲基乙二胺(TEMED)濃度為0.075%，聚丙烯酰胺濃度分別為2.5%和10%，濃縮膠中緩沖液濃度為0.125 mol/L Tris-HCl(pH6.8)，分離膠中緩沖液濃度為0.375mol/L Tris-HCl(pH8.8)，貯液槽中緩沖液濃度為0.025mol/L Tris-HCl/0.192mol/L 甘氨酸(pH8.3)。用0.0625mol/L Tris-HCl(pH6.8)樣品緩沖液(該緩沖液同時(shí)含有2%SDS、5% 2-巰基乙醇、10%甘油、0.002%溴酚藍(lán))溶解一定量分離蛋白粉，配成濃度為1mg/mL 的溶液。超聲波水浴處理45min，在沸水中加熱3min。點(diǎn)樣量為15μL，穩(wěn)壓電壓50V 進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行固定、染色、脫色。電泳譜圖采用CS910 型薄層掃描儀進(jìn)行掃描后，用ScionImage 軟件進(jìn)行處理分析。

1.2.4 乳狀液的制備 精確稱取1g 樣品，溶解于100mL 0.1mol/L 磷酸鈉緩沖溶液中，室溫下1000r/min攪拌1h 制備蛋白溶液，取0.1g 磷脂溶解于大豆油中，室溫下1000r/min 攪拌1h。取15mL 攪拌均勻的蛋白溶液與5mL 溶有磷脂的大豆油混合，在高速乳化均質(zhì)機(jī)下13500r/min 乳化2min 后倒入25mL 燒杯中。

1.2.5 乳狀液Zeta 的測定 根據(jù)CRUDDEN 的測定方法［6］。用pH7 的磷酸緩沖液將乳狀液稀釋至蛋白濃度0.125mg/mL，用Zeta 電位分析儀測定乳狀液的Zeta 電位。

1.2.6 粒徑的測定 采用Malvern 激光粒度分析儀測定粒度分布，測定溫度25℃。

1.2.7 乳狀液黏度的測定 采用Bohlin-CVO 流變儀，4/40 椎板，測定溫度25℃，剪切速率0.01 ～100s-1，測定表觀粘度。

1.2.8 表面疏水性的測定 參考KATO 等人的測定方法［7］。用濃度為0.01mol/L(pH 為7)的磷酸緩沖液將乳狀液稀釋，使蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0125%，取3mL 稀釋后的乳狀液，加入60μL ANS(濃度為8mmol/L)熒光探針，混勻，避光1min，于熒光分光光度計(jì)下比色測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長390nm，發(fā)射波長470nm。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 乳液均質(zhì)后立即進(jìn)行各指標(biāo)測定，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行三組平行樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝膠電泳圖譜分析

大豆7S、11S 球蛋白及SPI 凝膠電泳圖譜見圖1。通過對(duì)SDS- PAGE 譜圖中的譜帶進(jìn)行Scion Image 掃描分析，7S 的純度達(dá)到78.2%，11S 的純度達(dá)到88.7%。

圖1 7S、11S 球蛋白及SPI 電泳圖譜Fig.1 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of 7S，11S globulin and SPI fractions

2.2 粒徑分析

乳化體系形成后，乳化劑吸附在油水界面，穩(wěn)定液滴使其不發(fā)生聚集，通過峰變化范圍及峰面積觀察乳液中液滴大小分布情況。從圖2 可以看出，乳液出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，Brygida 研究牛乳蛋白乳液時(shí)也發(fā)現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，指出第一個(gè)峰為連續(xù)相中蛋白的粒徑分布峰［8］。蛋白乳液加入磷脂后，第一個(gè)峰面積均變大，第一個(gè)峰說明在乳化層界面磷脂與蛋白發(fā)生了相互作用，而使乳化層中的一部分蛋白被磷脂取代而進(jìn)入連續(xù)相水相中，Dickinson 的研究也發(fā)現(xiàn)磷脂的加入減少乳化層蛋白量［9］。蛋白乳液加入磷脂后三種乳液平均粒徑均變小，可能是磷脂的加入提高了蛋白的乳化性，高乳化性促進(jìn)乳液小液滴的生成。7S 乳液粒徑分布變化最明顯，說明磷脂與7S 作用最強(qiáng)。

圖2 乳液添加磷脂前后的粒徑分布Fig.2 The particle size distribution of soybean protein emulsions before and after adding lecithin

2.3 乳液粘度的測定

由圖3 可看出，大豆蛋白乳液在剪切速率0～1s-1的范圍內(nèi)，乳液的黏度隨著剪切速率的增加而降低，表現(xiàn)為剪切變稀，呈現(xiàn)假塑性流體特性。然而在高剪切速率下，由于聚集液滴被打破，黏度下降，出現(xiàn)牛頓流體性質(zhì)。添加磷脂后，乳液粘度下降，三種乳液黏度下降幅度相近，黏度下降可能是添加磷脂后，乳化性粒徑變小，根據(jù)Dougherty-Krieger 公式，由于液滴聚集產(chǎn)生大液滴增加了剪切黏度。

圖3 乳液添加磷脂前后的黏度曲線Fig.3 The flow curves of soybean protein emulsions before and after adding lecithin

2.4 乳液Zeta 的測定

由圖4 可看出，未添加磷脂的對(duì)照乳液Zeta 值均在-10～-13 之間，添加磷脂后，乳液的負(fù)Zeta 電位增加，均在-12～-16 之間，相差較小。7S 乳液的Zeta電位增加最大，SPI 乳液的Zeta 電位增加最小。說明添加磷脂后能增加乳狀液的負(fù)Zeta 電位，使蛋白顆粒之間的斥力增大，從而提高乳液的穩(wěn)定性，研究也表明7S-磷脂乳液的穩(wěn)定性最好［10］。磷脂能增加乳液的負(fù)Zeta 電位可能是磷脂與蛋白發(fā)生疏水相互作用，使蛋白結(jié)構(gòu)改變，從而引起Zeta 電位的改變。

圖4 乳液添加磷脂前后的Zeta 電位Fig.4 The zeta potential of soybean protein emulsions before and after adding lecithin

2.5 表面疏水性的測定

一般來說，多數(shù)構(gòu)成蛋白質(zhì)的非極性氨基酸側(cè)鏈分布在分子內(nèi)部形成疏水內(nèi)核，而極性氨基酸分布在表面的親水環(huán)境中。對(duì)于一些已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)表面性質(zhì)的分析表明，一些疏水基團(tuán)也會(huì)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)表面，使蛋白質(zhì)表面也具有一定的疏水性。ANS 法測定表面疏水性的原理是ANS 熒光團(tuán)與蛋白質(zhì)的表面疏水區(qū)域結(jié)合，通過測定結(jié)合前后的熒光變化計(jì)算蛋白質(zhì)的表面疏水性［11］。Ohtsuru 曾研究發(fā)現(xiàn)磷脂在蛋白疏水區(qū)與其作用，磷脂與蛋白有疏水作用發(fā)生［12］，為了研究大豆磷脂對(duì)不同球蛋白表面疏水性的影響，測定添加磷脂前后乳液的表面疏水性，結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可看出，當(dāng)添加磷脂后，三種乳液的疏水性均下降。

大豆球蛋白分子中含有的非極性氨基酸殘基可以和其他疏水物質(zhì)相互作用，如與油-水界面的作用。磷脂能降低球蛋白的表面疏水性，可能是由于具有較強(qiáng)疏水性的磷脂與球蛋白發(fā)生疏水相互作用使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，降低了疏水基團(tuán)的暴露，熒光探針結(jié)合不到疏水部位。在表面疏水性的測定中可看出7S 與磷脂作用前后表面疏水性降低的最多，這與粒徑測定結(jié)果相一致，都說明了磷脂與7S作用強(qiáng)度最大。

圖5 添加磷脂前后乳狀液表面疏水性Fig.5 The surface hydrophobicity of soybean protein emulsions before and after adding lecithin

3 結(jié)論

磷脂與球蛋白有疏水作用發(fā)生，這種相互作用導(dǎo)致球蛋白構(gòu)象發(fā)生一定改變，影響其功能性，進(jìn)而改變?nèi)橐盒再|(zhì)。添加大豆磷脂降低了蛋白乳狀液的粒徑，使乳狀液體系更加均一穩(wěn)定;三種蛋白乳液添加磷脂后黏度變小，Zeta 電位變大。磷脂與7S 球蛋白作用強(qiáng)度大于11S。本課題建立大豆蛋白-磷脂復(fù)合乳化體系，從大豆分離蛋白主要組分7S、11S 入手，研究了磷脂與SPI 主要組分作用機(jī)制及作用強(qiáng)度，為進(jìn)一步更好闡明磷脂對(duì)大豆分離蛋白乳化體系影響提供理論基礎(chǔ)，為生產(chǎn)加工中大豆分離蛋白種類的選擇提供理論指導(dǎo)。

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