羅格列酮對膿毒癥大鼠空腸短肽載體的調(diào)控機制研究

劉麗平，郭鴻，尹超，張磊，侯啟亮，張斌，劉健，李斌

羅格列酮對膿毒癥大鼠空腸短肽載體的調(diào)控機制研究

劉麗平，郭鴻，尹超，張磊，侯啟亮，張斌，劉健，李斌

目的探討羅格列酮對膿毒癥大鼠空腸短肽載體(PepT1)表達的調(diào)控作用及其機制。方法健康成年SD大鼠48只，隨機分為盲腸結扎穿刺(CLP)組(C組)、假手術組(S組)、羅格列酮組(R組)、羅格列酮+胰島素組(RI組)、CLP+胰島素組(CI組)和正常對照組(N組)，每組8只。C、CI、S組大鼠術前30m in給予等量生理鹽水灌胃；R、RI組CLP前30min給予羅格列酮(20mg/kg)灌胃；RI、CI組在CLP后150m in經(jīng)股靜脈注射胰島素(10U/kg)；N組大鼠未做任何處理。6組大鼠分別于術前30m in及術后30、60、90、120、150m in測空腹血糖，并在150m in時取動脈血和近端空腸待檢。采用紫外分光光度法測定血清D-乳酸水平，ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α、IL-10水平變化，Western blotting檢測空腸PepT1表達。結果術前給予羅格列酮可降低膿毒癥大鼠呼吸頻率、外周血中性粒細胞水平及CLP術后血糖，降低血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10水平以及D-乳酸水平，增加基礎狀態(tài)下和胰島素刺激下的PepT1表達。結論羅格列酮可通過降低炎性因子水平而提高膿毒癥時空腸腸黏膜PepT1的表達。

膿毒癥；胰島素；羅格列酮；寡肽轉(zhuǎn)運蛋白

膿毒癥是臨床常見的危重病癥，病情進展迅速，救治難度大，病死率高達30%～70%[1-2]。胃腸道是集營養(yǎng)、代謝、免疫和屏障等功能于一體的器官，也是膿毒癥過程中多器官功能衰竭(MODS)的啟動器官[3-5]。膿毒癥導致的腸道功能衰竭可引起明顯的腸內(nèi)營養(yǎng)吸收障礙。短肽載體(PepT1)是腸道吸收糖及蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物短肽(二肽、三肽)的主要途徑，胰島素在體外可調(diào)控PepT1的表達及功能，而膿毒癥狀況下存在胰島素抵抗。胰島素增敏劑羅格列酮為過氧化物酶體增生物激活受體γ(PPARγ)激動劑，可減輕炎癥反應，改善胰島素抵抗。本研究建立膿毒癥大鼠模型，以探討羅格列酮對膿毒癥腸道損傷的作用及其機制，尋求新的治療膿毒癥腸道吸收功能障礙的藥物靶點，為膿毒癥腸道功能障礙的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 健康雄性SD大鼠48只(蘭州大學動物實驗中心提供)，10～12周齡，體重270～340g，均給予標準飼養(yǎng)，自由飲水，術前12h禁食。D-乳酸標準品、D-乳酸脫氫酶及辣根過氧化物酶均購自美國Sigma公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒，白細胞介素6、10(IL-6、IL-10)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；抗大鼠PepT1抗體購自美國Santa Cruz生物公司；羅格列酮購自貴州圣濟堂制藥有限公司。

1.2分組及給藥 48只實驗大鼠隨機分為6組，每組8只。盲腸結扎穿刺(CLP)組(C組)：在CLP前30m in以生理鹽水灌胃；假手術組(S組)：手術過程基本同C組，但既不結扎也不穿刺盲腸，術前30m in予等量生理鹽水灌胃；羅格列酮組(R組)：在CLP前30m in予20mg/kg羅格列酮灌胃；羅格列酮+胰島素組(RI組)：CLP前30m in予20mg/kg羅格列酮灌胃，劑量和給藥時間參考文獻[5]、[6]，CLP后150m in股靜脈注射10U/kg胰島素；CLP+胰島素組(CI組)：手術過程同C組，在CLP后150m in由股靜脈注射10U/kg胰島素；正常對照組(N組)：大鼠未給予任何處理。CLP后每30m in測血糖1次，至第150m in結束(預實驗表明CLP后高血糖持續(xù)時間為180～210m in)。腹腔注射10%水合氯醛(3.6mg/kg)快速麻醉，股靜脈注射胰島素，3m in后心臟穿刺取血，離心，取上清－80℃保存，待測血清TNF-α、IL-6、IL-10及D-乳酸水平。切除長約5cm近端空腸，用載玻片刮取腸黏膜后立即于－80℃保存待測短肽載體。

1.3膿毒癥模型建立 按文獻[7]的方法行CLP。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.6mg/kg)快速麻醉后，行腹部正中切口(約2cm)，游離盲腸，在回盲瓣下結扎盲腸，保持腸管通暢，在腸系膜對側(cè)用20號針頭穿刺2次，輕輕擠壓保持穿刺點開放。開始計時后，將盲腸放回腹腔，用3號絲線連續(xù)縫合關腹。采用生理鹽水(50m l/kg)皮下注射復蘇代替術中的液體丟失，手術時間20m in。

1.4檢測指標 ①實驗前30m in記錄體重、空腹血糖。②采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清TNF-α、IL-6、IL-10水平。③采用酶聯(lián)紫外分光光度法測定血清D-乳酸水平，以評價腸道炎癥和損傷程度。④通過觸摸觀察胸廓動度檢測大鼠呼吸頻率，并按標準臨床檢驗學方法檢測中性粒細胞。⑤采用Western blotting檢測PepT1蛋白表達：空腸黏膜研磨后立即放入RIPA裂解液，離心30m in；吸取上清，考馬斯亮藍法(Brad ford法)測定樣本中的蛋白濃度；行丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜；加入抗大鼠PepT1抗體(含5%胎牛血清的PBS液按1:1000濃度稀釋)，4℃水平搖床緩慢搖晃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(含胎牛血清的PBS液按1:10 000濃度稀釋)，室溫下水平搖床上緩慢搖晃雜交2h。顯影，曝光，采集圖像并分析。

1.5統(tǒng)計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用重復測量設計的方差分析和單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1體重及血糖濃度 術前各組大鼠體重及體溫與術后150m in比較無明顯差別(P=0.970，P=0.920)。不同處理方式及不同時間點大鼠血糖值均有明顯差異(分別為F=9.262，P=0.001；F=25.067，P=0.000)。C組CLP術后各時間點血糖均較術前明顯升高(P＜0.05)，且術后30m in血糖高于120、150m in時(P＜0.05)。S組、R組、N組CLP術后各時間點血糖無明顯差異。C組CLP術后30、60m in時血糖較S、R、N組明顯升高(P＜0.05，表1)。

表1 CLP后各時間點血糖濃度(mmol/L，±s，n=8)Tab.1 Level of blood sugar at each time point after CLP (mmol/L±s,n=8)

表1 CLP后各時間點血糖濃度(mmol/L，±s，n=8)Tab.1 Level of blood sugar at each time point after CLP (mmol/L±s,n=8)

(1)P＜0.05 compared with group C; (2)P＜0.05 compared with 0m in; (3)P＜0.05 compared with 30m in

Group

2.2呼吸頻率及中性粒細胞計數(shù) 與S組比較，C組大鼠呼吸頻率在CLP后150m in明顯增快(P＜0.05)；與C組比較，R組大鼠呼吸頻率和中性粒細胞計數(shù)均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，即術前羅格列酮治療可降低膿毒癥大鼠呼吸頻率和中性粒細胞計數(shù)。各組大鼠CLP后150m in腹腔發(fā)臭，腸內(nèi)容物從穿刺孔流出，并有血性腹水。

2.3炎癥因子水平 與N組比較，C、S、R、RI、CI組TNF-α、IL-6、IL-10水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與R組比較，C組、CI組TNF-α、IL-6、IL-10水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，表2)。

2.4腸道炎癥和損傷程度評估 反映腸道炎癥和損傷程度的指標D-乳酸在C組(15.09±2.21mg/L)、S組(6.1±1.13mg/L)、R組(7.9±1.32mg/L)、RI組(7.1±1.21mg/L)、CI組(14.8±1.98mg/L)均較N組(3.8±0.89m g/L)升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與R組比較，C組、CI組D-乳酸水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.5空腸PepT1表達變化 與其他各組比較，C組PepT1表達明顯降低(P＜0.05)，即CLP降低PepT1表達。S、R、CI三組之間PepT1表達無明顯差異，與C組比較，R組PepT1表達增加(P＜0.05)，與CI組比較，RI組PepT1表達增加(P＜0.05)，即羅格列酮可增加基礎狀態(tài)下和胰島素刺激下的PepT1表達。PepT1表達在N組和RI組之間無明顯差異(P＝0.214，圖1)。

表2 各組炎癥因子水平比較(pg/L，±s，n=8)Tab.2 Comparison of inflammation factors in each group (pg/L，±s，n=8)

表2 各組炎癥因子水平比較(pg/L，±s，n=8)Tab.2 Comparison of inflammation factors in each group (pg/L，±s，n=8)

(1)P＜0.05 compared with N group; (2)P＜0.05 compared with R group

?

圖1 PepT1蛋白表達情況(Western blotting)Fig.1 Detection of PepT1 protein expression(Western blotting)

3 討 論

羅格列酮屬噻唑烷二酮類化合物，可激活胰島素主要靶組織中的PPARγ受體[8]，抑制促炎癥基因的表達，減少炎癥因子TNF-α、IL-6和PAI-1的釋放量。本研究表明，提前給予羅格列酮治療可明顯降低循環(huán)中的TNF-α濃度，此結果與其他研究一致[9]。

本研究結果顯示，CLP模型大鼠出現(xiàn)了高血糖癥，且血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10水平明顯升高，腸黏膜通透性增加，給予羅格列酮后血糖、炎性因子及腸黏膜通透性均降低。CLP后大鼠空腸PepT1表達降低，無論單獨應用還是與胰島素聯(lián)合應用，羅格列酮均能提高膿毒癥大鼠小腸黏膜PepT1的表達，即羅格列酮可上調(diào)膿毒癥大鼠小腸蛋白質(zhì)主要吸收途徑——PepT1的表達。

本研究結果還表明，CLP后大鼠空腸PepT1表達降低，而補充外源性胰島素可增加PepT1表達，說明膿毒癥大鼠腸道可能存在胰島素信號通路異常；羅格列酮可增加CLP后大鼠PepT1的表達，與羅格列酮降低炎性因子TNF-α、IL-6水平有關；CLP大鼠給予羅格列酮和胰島素后，PepT1表達較只給予胰島素時明顯增加，說明提前給予羅格列酮可通過降低炎性因子TNF-α、IL-6水平改善空腸局部的胰島素信號通路。

胰島素對腸道生長、細胞成熟、酶的表達等具有重要作用，可改善大鼠空腸短肽載體PepT1的表達及功能[10-11]，而PepT1參與小腸中二肽或三肽的轉(zhuǎn)運，是機體吸收蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物的主要途徑[12-13]。PepT1活性在臨床營養(yǎng)和藥物治療方面有重要作用[14-15]，調(diào)控膿毒癥短肽載體的表達，對改善腸功能障礙有重要意義。PepT1活性與胰島素水平有關，慢性胰島素缺乏可影響PepT1的表達及其轉(zhuǎn)運活性。膿毒癥大鼠出現(xiàn)高血糖癥，可能同時存在空腸胰島素信號通路異常；羅格列酮可能通過降低空腸局部的炎癥反應，改善異常的胰島素信號通路，對外源性胰島素調(diào)控PepT1起輔助作用。有文獻報道，磷脂酰肌醇-3激酶和磷酸肌醇依賴的激酶(PDK1)參與了正常情況下PepT1的調(diào)控[16]，羅格列酮增加PepT1表達可能與IRS/PI3K/Akt通路和磷酸化PKC有關，但仍需進一步研究證實。

綜上，本研究顯示，CLP后大鼠空腸PepT1表達下降，提前給予羅格列酮可通過降低炎癥反應改善嚴重感染并發(fā)的高血糖癥，維持腸道短肽載體PepT1的水平，此結果可能為臨床感染患者的營養(yǎng)支持模式提供理論依據(jù)，為臨床保護和支持腸道功能提供有效途徑。

[1] Jiao LN, Yao YM, Shou ST. Effects of XUEBIJING injection on hepatic gelsolin and inflammatory cytokine in septic rats[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(1): 14-16. [焦麗娜, 姚詠明, 壽松濤. 血必凈注射液對膿毒癥大鼠肝組織凝溶膠蛋白及炎癥因子的影響[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2011, 36(1): 14-16.]

[2] Wang ZG. Viewpoint on the current status of researches on sepsis[J]. Med J Chin PLA, 2012, 37(11): 1011-1014. [王正國.當前膿毒癥研究的思考[J]. 解放軍醫(yī)學雜志, 2012, 37(11): 1011-1014.]

[3] Van den Berghe G. How does blood glucose control with insulin save lives in intensive care[J]? J Clin Invest, 2004, 114(9): 1187-1195.

[4] Cuzzocrea S, Pisano B, Dugo L,etal. Rosiglitazone and 15-deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2, ligands of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR-gamma), reduce ischaem ia/reperfusion injury of the gut[J]. Br J Pharmacol, 2003, 140(2): 366-376.

[5] Wang WP, Zheng XY, Zhu ZQ,etal. Effects of early using of low dose short peptide enteral nutrition on serum IL-6 level in patients with sepsis[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2010, 45(2): 299-301. [王萬朋, 鄭湘予, 朱志強, 等. 早期低劑量應用短肽類腸內(nèi)營養(yǎng)液對膿毒癥患者血清白細胞介素-6水平的影響[J]. 鄭州大學學報(醫(yī)學版), 2010, 45(2): 299-301.]

[6] Bao Y, Jia RH, Yuan J,etal. Renal protection of rosiglitazone and its mechanism in diabetic rats[J]. Chin J Nephrol, 2007, 4(23): 224-229. [包艷, 賈汝漢, 袁軍, 等. 羅格列酮對糖尿病大鼠腎臟保護作用機制的探討[J]. 中華腎臟病雜志, 2007, 4(23): 224-229.

[7] Singleton KD, W ischmeyer PE. Distance of cecum ligated in fluences mortality, tum o r necrosis facto r-alpha and interleukin-6 expression following cecal ligation and puncture in the rat[J]. Eur Surg Res, 2003, 35(6): 486-491.

[8] Deng WJ, Ma XJ, Qiu HL,etal. The effect of rosiglitazone and repaglinide on pathophysiology in patients with new ly diagnosed type 2 diabetes[J]. Chin J Pract Intern Med, 2010, 30(9): 823-826. [鄧文娟, 馬曉靜, 邱慧玲, 等. 羅格列酮及瑞格列奈對新診斷2型糖尿病急性相胰島素分泌功能影響的研究[J]. 中國實用內(nèi)科雜志, 2010, 30(9): 823-826.]

[9] Schm idt MV, Brüne B, von Knethen A. The nuclear hormone receptor PPARγ as a therapeutic target in major diseases[J]. Sci World J, 2010, 10: 2181-2197.

[10] Bikhazi AB, Skoury MM, Zwainy DS. Effect of diabetes mellitus and insulin on the regulation of the PepT 1 symporter in rat jejunum[J]. Mol Pharm, 2004, 1(4): 300-308.

[11] Der-Boghossian AH, Saad SR, Perreault C,etal. Role of insulin on jejunal PepT1 expression and function regulation in diabetic male and female rats[J]. Can J Physiol Pharmacol, 2010, 88(7): 753-759.

[12] Ogihara H, Saito H, Shin BC,etal. Immuno-localization of H+/ peptide cotransporter in rat digestive tract[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 220(3): 848-852.

[13] Shi B, Song D, Xue H,etal. Abnormal expression of the peptide transporter PepT1 in the colon of massive bowel resection rat: a potential route for colonic mucosa damage by transport of fMLP[J]. Dig Dis Sci, 2006, 51(11): 2087-2093.

[14] Mathews D, Adibi SA. Peptide absorption[J]. Gastroenterology, 1976, 71(1): 151-161.

[15] Adibi SA. The oligopeptide transporter (PepT-1) in human intestine: bio logy and function[J]. Gastroenterology, 1997, 113(1): 332-340.

[16] Rexhepaj R, Rotte A, Pasham V,etal. PI3 kinase and PDK1 in the regu lation of the electrogenic intestinal dipep tide transport[J]. Cell Physiol Biochem, 2010, 25(6): 715-722.

Regulation mechanism of rosiglitazone on the oligopeptide transporter (Pep T1) in sep tic rats after cecal ligation and puncture

LIU Li-ping, GUO Hong, YIN Chao, ZHANG Lei, HOU Qi-liang, ZHANG Bin, LIU Jian, LI Bin*
Department of Critical Care Medicine, First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
*

, E-mail: lynd0001@163.com
This work was supported by the Research Project Funds for the Central Universities (lzujbky-2010-202)

ObjectiveTo exp lore the regulation effect and its mechanism of rosiglitazone on the oligopeptide transporter (PepT1) expression in rats after cecal ligation and puncture (CLP).MethodsForty-eight SD rats were random ly divided into 6 groups (8 each): CLP group (C group), sham operation group (S group), CLP+rosiglitazone group (R group), CLP+rosiglitazone+insulin group (RI group), CLP+insulin group (CI group), and normal control group (N group). Rats in C, S and CI groups

0.9% NaCl solution by intragastric administration 30min before CLP or sham operation, while in R and RI group, rats received rosiglitazone instead. Rats in RI and CI group received insulin through femoral vein 150m in after CLP. Glucose was measured at 30min preoperatively and every 30min postoperatively (30, 60, 90, 120, 150min). Arterial blood and proximal jejunum were harvested at 150min. Plasma D-lactate was determined by ultraviolet spectrophotometry. Serum IL-6, TNF-α and IL-10 were determ ined by ELISA. Pept1 expression was detected by Western blotting.ResultsWhen rosiglitazone was given preoperatively, the respiratory rate, neutrophil count, glucose concentration, and the levels of TNF-α, IL-6, IL-10 and plasma D-lactate all decreased significantly after CLP (P＜0.05 orP＜0.01). Rosiglitazone-pretreatment increased PepT1 expression in both baseline and insulininduced conditions (P＜0.05).ConclusionRosiglitazone may increase the PepT1 expression in jejunal mucosa by reducing inflammatory cytokines in sepsis.

sepsis; insulin; rosiglitazone; oligopeptide transporter

R631

A

0577-7402(2013)07-0557-04

2012-12-27；

2013-05-27)

(責任編輯：熊曉然)

中央高?；究蒲袠I(yè)務費自由探索項目(lzujbky-2010-202)

劉麗平，醫(yī)學碩士。主要從事重癥醫(yī)學方面的研究

730000 蘭州 蘭州大學第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科(劉麗平、郭鴻、尹超、張磊、侯啟亮、張斌、劉健、李斌)

李斌，E-mail: lynd0001@163.com