聚肌胞苷酸、脂多糖及肽聚糖對人氣道黏膜天然免疫功能影響的實驗研究

張景熙，趙立軍，石薈，白沖，李強(qiáng)

聚肌胞苷酸、脂多糖及肽聚糖對人氣道黏膜天然免疫功能影響的實驗研究

張景熙，趙立軍，石薈，白沖，李強(qiáng)

目的研究聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]、脂多糖(LPS)及肽聚糖(PGN)對人氣道黏膜屏障及炎性介質(zhì)表達(dá)的影響，進(jìn)而了解氣道黏膜對不同Toll樣受體配體的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)。方法采用Transwell系統(tǒng)培養(yǎng)人16HBEs氣道上皮細(xì)胞建立人氣道黏膜體外模型，分別給予Poly(I:C)、LPS及PGN頂側(cè)刺激，對照組僅給予MEM+GlutaMax-Ⅰ培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過測定跨膜電阻抗(TER)判斷16HBEs細(xì)胞間的小分子通透性，測定基底側(cè)培養(yǎng)液中FITC-右旋糖酐濃度判斷大分子細(xì)胞通透性，用ELISA法檢測干預(yù)24h后培養(yǎng)細(xì)胞頂側(cè)及基底側(cè)上清液中IL-8、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)及TNF-α的蛋白含量。結(jié)果10μg/m l Poly(I:C)導(dǎo)致人氣道上皮細(xì)胞間TER顯著降低，F(xiàn)ITC-右旋糖酐通透性增加(P＜0.01)，10μg/m l LPS及100μg/m l PGN刺激對氣道上皮細(xì)胞TER及FITC-右旋糖酐通透性無明顯影響。IL-8和TNF-α表達(dá)在Poly(I:C)、LPS及PGN組細(xì)胞頂側(cè)和基底側(cè)均較對照組顯著增加(P＜0.05)。GM-CSF表達(dá)在3組細(xì)胞頂側(cè)均較對照組增加(P＜0.05)，僅Poly(I:C)組基底側(cè)表達(dá)較對照組增加(P＜0.05)，LPS和PGN組基底側(cè)與對照組比較無明顯變化。Poly(I:C)組、LPS組和PGN組細(xì)胞頂側(cè)IL-8和GM-CSF濃度增高程度高于基底側(cè)，形成濃度梯度。結(jié)論P(yáng)oly(I:C)可破壞氣道黏膜屏障完整性，導(dǎo)致小分子和大分子通透性增加，同時刺激細(xì)胞定向向頂側(cè)分泌炎性介質(zhì)，LPS及PGN對氣道黏膜屏障無影響，但能誘導(dǎo)細(xì)胞向頂側(cè)定向分泌炎性介質(zhì)，提示病毒及細(xì)菌感染所致氣道炎癥與Toll樣受體通路介導(dǎo)的氣道黏膜天然免疫應(yīng)答有關(guān)。

氣道上皮細(xì)胞；聚肌胞苷酸；脂多糖類；肽聚糖；免疫，天然；免疫，黏膜

人體呼吸道黏膜直接與外界相通，形成一道天然屏障抵御病原微生物的入侵[1]。作為機(jī)體防御系統(tǒng)的第一道防線，黏膜免疫發(fā)揮著重要作用，致病性病原體侵入機(jī)體后，首先遭遇到天然免疫的抵抗，隨后產(chǎn)生獲得性免疫，兩者共同發(fā)揮防御作用[2]。病毒及細(xì)菌是引起下呼吸道感染的主要病原體，也是多種慢性氣道疾病急性加重的重要誘因[3-4]。病毒或細(xì)菌進(jìn)入下呼吸道后首先與氣道黏膜接觸，氣道黏膜上皮細(xì)胞通過自身表達(dá)的多種模式識別受體來識別不同病原體并產(chǎn)生應(yīng)答，參與病原體清除及氣道炎癥的發(fā)生[4-5]。

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)是一個重要的模式識別受體家族，其中TLR2、TLR3、TLR4分別特異性識別肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、雙鏈RNA及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)[6]。雙鏈RNA是多種呼吸道病毒在細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物，聚肌胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid)簡稱Poly(I:C)，是一種人工合成的雙鏈RNA，能特異性地與細(xì)胞內(nèi)TLR3結(jié)合，因其結(jié)構(gòu)類似于多種病毒在細(xì)胞內(nèi)代謝所產(chǎn)生的核糖核酸，常被用作病毒感染的模擬物[7]。PGN和細(xì)菌內(nèi)毒素LPS分別是革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)，能夠被上皮細(xì)胞表達(dá)的TLR2和TLR4特異性識別[8]。目前病毒及細(xì)菌感染相關(guān)的TLR特異性配體對氣道黏膜天然免疫應(yīng)答影響的研究較少。本研究采用氣道黏膜體外模型，分別給予Poly(I:C)、LPS和PGN刺激，觀察三者對氣道黏膜體外模型天然免疫反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 人支氣管上皮細(xì)胞株16HBEs由英國南安普頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院Davies DE教授惠贈，Transwell培養(yǎng)皿購于Corning公司，Ⅰ型膠原購自Fremont公司，MEM+GlutaM ax-I培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素購自Gibco公司，銅綠假單胞菌內(nèi)毒素(LPS)、PGN、4kD異硫氰酸熒光素-右旋糖酐(fluorescein-5-isothiocyanate dextra，F(xiàn)ITC-Dextran)購自Sigma公司，ELISA試劑盒購自R&D公司。Fluoroskan Ascent FL2.5儀購自 Thermofisher Scientific公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組 將16HBEs細(xì)胞常規(guī)接種于含10%FBS的MEM+GlutaMax-I培養(yǎng)液(青霉素50U/m l，鏈霉素50μg/m l)的12孔Transwell培養(yǎng)板中，接種密度為0.15×106/m l，培養(yǎng)瓶提前30min用1:100 Ⅰ型膠原包被，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。

實驗分4組，即對照組，Poly(I:C)組，LPS組，PGN組，各組細(xì)胞在刺激前，頂側(cè)和基底側(cè)分別給予200μl MEM+GlutaMax-I培養(yǎng)液和500μl含10%FBS的MEM+GlutaMax-I培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，然后按照分組分別給予10μg/m l Poly(I:C)，10μg/m l LPS和100μg/ m l PGN刺激，對照組給予MEM+GlutaMax-I培養(yǎng)液。實驗至少重復(fù)3次。

1.2.2細(xì)胞間離子通透性測定 通過測量跨膜電阻抗(trans-epithelial electrical resistance，TER)的方法測定細(xì)胞間離子通透性，采用EVOM上皮伏歐表(WPI公司)測定16HBEs細(xì)胞培養(yǎng)1周后的電阻，TER大于260Ω·cm2提示細(xì)胞生長融合良好、細(xì)胞間連接完整。分別測量刺激前及刺激后1、2、3、4、6、8、24h的TER值，記錄刺激后各時間點(diǎn)TER占刺激前(記時間點(diǎn)為0h)TER值的百分比(%)。

1.2.3細(xì)胞間大分子通透性測定 測定FITC-右旋糖酐的濃度(μg/m l)以反映細(xì)胞間大分子通透性。按分組施加干預(yù)2h后在16HBEs細(xì)胞頂側(cè)加入2mg/m l 4kD FITC-右旋糖酐，24h后應(yīng)用Fluoroskan Ascent FL2.5儀測定基底側(cè)培養(yǎng)基FITC-右旋糖酐吸光值，激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長530nm，以乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)刺激作為陽性對照。

1.2.4ELISA法測定白介素8(IL-8)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)蛋白的表達(dá) 采用ELISA法檢測刺激24h后頂側(cè)及基底側(cè)培養(yǎng)基中IL-8、GM-CSF及TNF-α的蛋白濃度，操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。先在酶譜儀上測量標(biāo)準(zhǔn)品吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測量樣品吸光度(A)值，每個樣品重復(fù)2孔檢測，并根據(jù)測得的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品濃度。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行資料錄入、整理及統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞間通透性檢測結(jié)果 10μg/m l Poly(I:C)從頂側(cè)刺激16HBEs細(xì)胞2、3、4、6、8、24h后，TER均較對照組下降，分別為對照組相應(yīng)時間點(diǎn)的89.9%、77.5%、77.1%、74.3%、73.2%、32.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)，10μg/m l LPS或100μg/m l PGN從頂側(cè)刺激16HBEs細(xì)胞后1、2、3、4、6、8、24h，TER與對照組比較均無明顯下降，提示Poly(I:C)可增加16HBEs細(xì)胞間離子通透性，而LPS及PGN刺激對細(xì)胞間離子通透性無明顯影響。

2.2細(xì)胞間大分子通透性檢測結(jié)果 10μg/m l Poly(I:C)從頂側(cè)刺激16HBEs細(xì)胞24h后，基底側(cè)FITC-右旋糖酐濃度(295.81±45.46μg/m l)是對照組(75.81±5.82μg/m l)的3.9倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，10μg/m l LPS和100μg/m l PGN從頂側(cè)刺激16HBEs細(xì)胞24h后，細(xì)胞基底側(cè)FITC-右旋糖酐濃度分別為84.59±8.96μg/m l和90.20±16.06μg/m l，與對照組比較無明顯差異，提示Poly(I:C)可增加16HBEs細(xì)胞間大分子的通透性，而LPS及PGN刺激對細(xì)胞間大分子通透性并無明顯影響(圖1B)。

圖1 Poly(I:C)(10μg/m l)、LPS(10μg/m l)、PGN(100μg/ m l)經(jīng)Transwell系統(tǒng)頂側(cè)刺激對16HBEs細(xì)胞間通透性的影響Fig. 1 Effect of apical stimulation of Poly(I:C)(10μg/m l), LPS(10μg/m l) and PGN(100μg/m l) on the permeability between cellsviatranswell system

2.3細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)IL-8、GM-CSF及TNF-α蛋白的檢測結(jié)果 10μg/m l Poly(I:C)、10μg/m l LPS和100μg/m l PGN從頂側(cè)刺激16HBEs細(xì)胞24h后，向頂側(cè)分泌的IL-8蛋白水平均較對照組升高，分別是對照組的4.38、2.35、2.40倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，表1)，各刺激組向基底側(cè)分泌的IL-8蛋白較對照組基底側(cè)升高，分別是對照組的3.15、1.35、1.32倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05，表1)。

Poly(I:C)、LPS和PGN從頂側(cè)刺激16HBEs細(xì)胞24h后，向頂側(cè)分泌的GM-CSF蛋白水平均較對照組升高，分別是對照組的13.64、3.68、3.31倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，Poly(I:C)刺激組向基底側(cè)分泌的GM-CSF蛋白較對照組升高，是對照組的1.53倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，LPS和PGN刺激組向基底側(cè)分泌的GM-CSF蛋白與對照組比較無明顯差異(表1)。

Poly(I:C)、LPS和PGN從頂側(cè)刺激16HBEs細(xì)胞24h后，向頂側(cè)分泌的TNF-α蛋白水平均較對照組明顯升高，分別是對照組的4.22、1.81、2.02倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，各刺激組向基底側(cè)分泌的TNF-α蛋白較對照組明顯升高，分別是對照組的4.82、1.83、2.03倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05，表1)。

表1 Poly(I:C)、LPS及PGN刺激后16HBEs細(xì)胞向頂側(cè)及基底側(cè)分泌IL-8、GM-CSF和TNF-α的含量(pg/m l，±s，n=3)Tab. 1 Apical and basal content of IL-8, GM-CSF and TNF-α in 16HBEs after stimulation by Poly(I:C), LPS and PGN(pg/m l,±s,n=3)

表1 Poly(I:C)、LPS及PGN刺激后16HBEs細(xì)胞向頂側(cè)及基底側(cè)分泌IL-8、GM-CSF和TNF-α的含量(pg/m l，±s，n=3)Tab. 1 Apical and basal content of IL-8, GM-CSF and TNF-α in 16HBEs after stimulation by Poly(I:C), LPS and PGN(pg/m l,±s,n=3)

(1)P＜0.05, (2)P＜0.01 compared with control group

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3 討 論

天然免疫應(yīng)答是氣道黏膜抵御外界病原體的一種與生俱來的防御機(jī)制。氣道上皮細(xì)胞通過自身表達(dá)的多種Toll樣受體來特異性識別不同病原體的特定結(jié)構(gòu)，啟動防御機(jī)制并清除入侵病原體[9-10]。氣道黏膜通過氣道上皮細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成一道天然物理屏障，不僅具有控制細(xì)胞生長分化、維持上皮細(xì)胞正常極性及通透性的作用，還將黏膜下組織結(jié)構(gòu)與外界隔絕，避免病原體向下侵襲[11]，維持黏膜屏障的完整性，是發(fā)揮天然免疫功能的一個重要方面。本研究發(fā)現(xiàn)，TLR3特異性配體Poly(I:C)可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞間離子及大分子物質(zhì)通透性增加，而LPS及PGN對細(xì)胞間通透性無明顯影響，表明TLR3受體激活是破壞氣道黏膜完整性的一個相關(guān)因素。文獻(xiàn)報道，LPS能破壞血-腦脊液[12]、腸道[13]等黏膜屏障，PGN刺激后皮膚角質(zhì)細(xì)胞通透性增加[14]，這些差異可能與實驗細(xì)胞的種系不同有關(guān)，也反映出相同的TLR配體對不同黏膜的影響有所不同。氣道黏膜屏障破壞有可能為細(xì)菌、各種抗原侵襲深部組織創(chuàng)造條件。Sajjan等[15]報道鼻病毒(RV)感染后氣道黏膜屏障被破壞，流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌通過細(xì)胞間向下侵襲的數(shù)量相應(yīng)增加，可見維持黏膜屏障的完整性對避免黏膜下組織損傷具有一定意義。

氣道上皮細(xì)胞在病原微生物等外界刺激下可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，這種化學(xué)屏障功能具有招募并激活免疫細(xì)胞參與局部炎癥的重要作用，是氣道黏膜天然免疫反應(yīng)的另一組成部分[11]。Ohkuni等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Poly(I:C)刺激人原代鼻黏膜上皮細(xì)胞后，不僅細(xì)胞間通透性增加，而且IL-8和TNF-α蛋白的分泌明顯增加，表明上呼吸道黏膜物理屏障破壞與炎性介質(zhì)表達(dá)增加同時存在，并都與p38MAPK被激活有關(guān)，提示兩種反應(yīng)共用同一條信號通路。本研究顯示，Poly(I:C)、LPS及PGN可不同程度地刺激氣道上皮細(xì)胞表達(dá)IL-8、GM-CSF及TNF-α蛋白，其中以Poly(I:C)的刺激作用最為明顯。IL-8是一種重要的中性粒細(xì)胞趨化因子，可招募循環(huán)中的中性粒細(xì)胞向組織浸潤并釋放溶酶體酶，產(chǎn)生活性氧，從而損傷周圍組織[17]。GM-CSF具有調(diào)節(jié)嗜酸細(xì)胞成熟、分化、活化、凋亡和脫顆粒等功能，參與嗜酸細(xì)胞性炎癥的形成[18]。前炎性細(xì)胞因子TNF-α主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生[19]，可引起血管內(nèi)皮損傷，增加微血管通透性，誘導(dǎo)上皮、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，刺激血小板活化因子(PAF)、前列腺素(PGs)、白三烯(LTs)等炎性介質(zhì)合成，同時具有促進(jìn)IL-8、GM-CSF分泌，加重炎癥細(xì)胞浸潤與活化等作用[20]。本研究結(jié)果表明，氣道上皮細(xì)胞是病原體感染后多種炎性因子產(chǎn)生的重要來源之一。LPS及PGN刺激后炎性介質(zhì)表達(dá)雖升高，但對黏膜屏障無明顯影響，說明化學(xué)屏障的激活與物理屏障的破壞不一定會同時出現(xiàn)，提示黏膜屏障及炎性介質(zhì)表達(dá)可能受不同信號通路的調(diào)控，其分子機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

黏膜屏障破壞有利于病原體向深部侵襲，造成黏膜下組織細(xì)胞的激活，如Papadopoulos等[21]曾在病毒感染后的氣道黏膜下成纖維細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)病毒顆粒，而多種細(xì)胞的激活成為炎性介質(zhì)增多的其他來源，如Bedke等[22]發(fā)現(xiàn)鼻病毒感染刺激人支氣管成纖維細(xì)胞IL-6、IL-8、RANTES分泌增多，Baines等[23]發(fā)現(xiàn)LPS刺激后中性粒細(xì)胞中IL-8、IL-1β和TNF-α分泌增加，因此我們推測氣道上皮細(xì)胞是病原體進(jìn)入下呼吸道后首先接觸的靶器官，氣道黏膜的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)可能是氣道炎癥的一個啟動因素。

我們前期研究顯示，Poly(I:C)及LPS刺激單層培養(yǎng)的16HBEs細(xì)胞后，IL-8和IP-10等炎性介質(zhì)表達(dá)增高[24]。上皮細(xì)胞生長時會產(chǎn)生極性，導(dǎo)致頂側(cè)與基底細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和受體表達(dá)有所不同[25]，但其生物學(xué)功能方面的差異尚不得而知。在本研究中，我們采用Transwell系統(tǒng)培養(yǎng)的16HBEs具有正常細(xì)胞極性，為研究細(xì)胞頂側(cè)與基底側(cè)的功能差異提供了一種可選擇的體外氣道黏膜模型[26]。本實驗結(jié)果顯示，IL-8及GM-CSF在細(xì)胞頂側(cè)的濃度有高于基底側(cè)的趨勢，表明氣道上皮細(xì)胞具有介導(dǎo)部分炎性介質(zhì)定向表達(dá)的能力，炎性介質(zhì)向腔面一側(cè)釋放形成濃度梯度，部分解釋了炎性細(xì)胞向氣道浸潤及向氣道腔內(nèi)聚集的分子機(jī)制。同時我們發(fā)現(xiàn)，GMCSF在Poly(I:C)刺激后形成的濃度差異遠(yuǎn)較IL-8及TNF-α的濃度差異明顯，可能有利于嗜酸細(xì)胞向黏膜下聚集，導(dǎo)致氣道炎癥向Th2型炎癥方向傾斜。

綜上，Poly(I:C)可在導(dǎo)致人氣道黏膜屏障破壞的同時刺激細(xì)胞向頂側(cè)方向分泌炎性介質(zhì)，LPS及PGN亦可刺激氣道上皮細(xì)胞分泌炎性介質(zhì)，提示病毒及細(xì)菌感染所致氣道炎癥與氣道黏膜天然免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)，進(jìn)一步深入研究其分子機(jī)制將為控制氣道炎癥提供新的手段。

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Effects of Poly(I:C), LPS and PGN stimulation on the innate immune function of human bronchial epithelium

ZHANG Jing-xi, ZHAO Li-jun, SHI Hui, BAI Chong, LI Qiang
Department of Respiratory Diseases, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81100017) and Shanghai Health Bureau Foundation(2010065)

ObjectiveTo study the effect of polyinosinic:polycytidylic acid (poly(I:C)), lipolysaccharide (LPS), peptidoglycan (PGN) on the barrier function and inflammatory mediators release of bronchial epithelium, and explore the impact of different specific Toll-like receptor (TLR 2, 3, 4) ligands on airway mucosal innate immune responses.MethodsPolarized human bronchial epithelial cells (16HBEs) were cultured using transwell system to establish human bronchial epithelium modelinvitro. The stimulation of Poly(I:C), LPS and PGN, respectively, was given on 16HBEs apically. The permeabilities of m icromolecule and macromolecule between cells were measured by detecting trans-epithelial electrical resistance (TER) and basolateral medium FITC-dextran concentrations after 24h stimulation. IL-8, GM-CSF and TNF-α protein content of apical and basal supernatants released by 16HBEs were measured by ELISA after 24h stimulation.Results10μg/m l Poly(I:C) resulted in decrease of TER and reduction of increase of FITC-dextran permeability significantly (P＜0.001), while 10μg/m l LPS and 100μg/m l PGN showed no obvious effects on TER and FITC-dextran permeability. Poly(I:C), LPS and PGN induced an increase in apical and basolateral IL-8, TNF-α release and apical GM-CSF release of the cells. There was no change in basal expression of GM-CSF after being stimulated by LPS and PGN. The apical increase in IL-8 and GM-CSF was higher in Poly(I:C), LPS and PGN groups than their basal increase, thus forming the concentration gradient between two sides of the polarized cells.ConclusionsPoly (I:C) can damage the barrier integrity of the bronchial epithelium, leading to an increase in m icromolecular and macromolecular permeability, and induce the secretionof inflammatory mediators towards the top side at the same time. LPS and PGN can only induce the secretion of inflammatory mediators towards the top side m ildly, w ithout affecting the barrier function. It is suggested that airway mucosal innate immune response through TLR signaling pathways may be involved in airway inflammation caused by virus and bacterial infection.

epithelial cells; poly I-C; lipopolysaccharides; peptidoglycan; immunity, natural; immunity, mucosal

R562

A

0577-7402(2013)07-0552-05

2012-12-29；

2013-03-17)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

國家自然科學(xué)基金(81100017)；上海市衛(wèi)生局面上項目基金(2010065)

張景熙，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，副教授。主要從事氣道黏膜屏障與免疫方面的研究

200433 上海 第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院呼吸內(nèi)科(張景熙、趙立軍、石薈、白沖、李強(qiáng))