腫瘤壞死因子α誘導胰島素抵抗細胞模型的建立及鑒定＊

陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)科（西安710068） 朱舜明 官功昌 程 功 趙 欣 朱火蘭

胰島素抵抗（IR）不僅是2型糖尿病發(fā)病的重要病理生理機制，也是中心性肥胖、糖代謝異常、脂代謝紊亂（高甘油三酯血癥和／或高密度脂蛋白降低）、微量白蛋白尿、高血壓、冠心病等疾病的共同土壤。胰島素抵抗已成為當今醫(yī)學的研究熱點之一。研究以3T3－L1前脂肪細胞為研究對象，通過TNF－α誘導分化成熟的脂肪細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，從而建立胰島素抵抗細胞模型。

材料與方法

1 材 料 細胞3T3－L1前脂肪細胞系購自ATCC（American Type Culture Collection）。試 劑DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自GIBCO公司。異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、胰島素（INS）、腫瘤壞死因子α（TNF－α）、cytochalasin B、牛血清蛋白購自 Sigma－Aldrich公司。3H－2－DG 購 自 GE 公 司 公司。油紅 O、BCA蛋白分析試劑盒、Triton X－100購自鼎國公司。膜蛋白提取試劑盒購自Bestbio公司。PPO、POPOP購自上?；瘜W試劑廠。二氧化碳孵箱，Thermo公司；LS 6500液態(tài)閃爍儀，Beckman公司；酶標儀，Molecular Devices公司；熒光倒置顯微鏡，奧林巴斯公司。

2 方 法 ①3T3－L1前脂肪細胞的培養(yǎng)及誘導分化：3T3－L1前脂肪細胞用高糖DMEM（含10%胎牛血清及青霉素、鏈霉素）作為培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱，待細胞產(chǎn)生接觸抑制后傳代，調(diào)節(jié)細胞密度并接種于12孔培養(yǎng)板中。數(shù)天后，細胞產(chǎn)生接觸抑制，2d后更換培養(yǎng)基為高糖DMEM 培養(yǎng)基，其中含有IBMX（0．5mM）IBMX（0．5mM）、地塞米松（1μM）和胰島素（10μg／ml）。再過2d后，培養(yǎng)基更換為只含有10%胎牛血清和胰島素（10μg／ml）。再過兩天后，更換培養(yǎng)基為普通高糖DMEM培養(yǎng)基。8～12d后，大部分細胞分化為成熟的脂肪細胞。觀察細胞分化過程中細胞形態(tài)的變化。②油紅O染色鑒定成熟脂肪細胞：用異丙醇溶解油紅O。將成熟3T3－L1脂肪細胞用冷丙酮固定。洗滌后向12孔板中每孔加入終濃度為0．3g／100ml的油紅O工作液約350ml，在室溫下染色約2h。洗滌后熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及染色。③TNF－α誘導成熟脂肪細胞產(chǎn)生胰島素抵抗：分化成熟的脂肪細胞在無血清，含有0．5% （w／v）牛血清白蛋白的高糖 DMEM中培養(yǎng)3h。將成熟脂肪細胞分為對照組、1μM TNF－α組、10μM TNF－α組、和 100μM TNF－α組，每組 24孔。3h后，3組TNF－α處理細胞培養(yǎng)基更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24h；對照組細胞更換為僅含10%胎牛血清的高糖DMEM。24h后，更換培養(yǎng)基為含有100nM胰島素和10%胎牛血清的高糖DMEM繼續(xù)作用30min。分別收集對照組和TNF－α處理組細胞，進行葡萄糖攝取實驗鑒定是否成功建立胰島素抵抗脂肪細胞模型。④3H葡萄糖攝取實驗：將各組細胞用KRP緩沖液振蕩洗滌。以1μCi／ml為終濃度將含有3H－2－DG的DMEM培養(yǎng)液加入到12孔板。10min后，用冰KRP緩沖液洗滌，終止反應。再用0．1NNaOH溶解細胞。將細胞懸液加入到液態(tài)閃爍液中，用液閃儀檢測每分鐘衰變（DPM）。加入100nM cytochalasin B去除非特異性葡萄糖攝取。將測得的DPM值減去100nM cytochalasin B處理的DPM值即為該組細胞葡萄糖攝取的DPM值。通過BCA蛋白試劑盒測定每孔細胞懸液蛋白含量，單位蛋白所攝取的DPM即可通過蛋白含量可算出，單位為nmol 2－DOG／mg protein／min。

3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Prism5．0軟件。采用t檢驗對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 IBMX、地塞米松和胰島素能誘導3T3－L1前脂肪細胞成為成熟脂肪細胞 體外培養(yǎng)的3T3－L1前脂肪細胞誘導分化前細胞呈梭形，胞漿中無脂滴，表現(xiàn)為成纖維細胞樣的前脂肪細胞形態(tài)。融合后，細胞處于生長停滯期，細胞不再繼續(xù)分裂（圖1）。加入IBMX、地塞米松和胰島素誘導劑作用12d后，細胞變大，變圓，可見脂滴積累，形成典型的“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)（圖2）。經(jīng)油紅O染色鑒定為成熟脂肪細胞（圖3）。用于下一步實驗。

2 10μM TNF－α能顯著降低3T3－L1脂肪細胞對胰島素的敏感性 將誘導成功的成熟脂肪細胞經(jīng)不同劑量TNF－α作用后，加入100nM胰島素進行刺激，通過3H葡萄糖攝取實驗測定各組細胞的葡萄糖攝取。發(fā)現(xiàn)：1μM、10μM 及100μM TNF－α都能使胰島素刺激的葡萄糖攝取下降，其中10μM TNF－α的作用效果最為顯著（P＜0．05）（圖4）。

圖4 與對照組相比，10μM TNF－α能顯著降低胰島素刺激的葡萄糖攝取

討 論

胰島素抵抗（IR）是指機體或細胞對胰島素不敏感的一種狀態(tài)，也就是指：胰島素作用的靶器官，主要包括骨骼肌，脂肪及肝臟，對胰島素的敏感性和（或）反應性降低。IR不僅是2型糖尿?。═2DM）發(fā)病的重要病理生理機制，也是機體發(fā)生代謝綜合征（MS）的核心機制。作為胰島素在外周重要的靶器官之一，脂肪細胞也成為體外研究胰島素抵抗的常用細胞模型。

TNF－α具有廣泛生物學功能。雖然TNF－α通過活化巨噬細胞和T細胞等免疫細胞具有間接的抗腫瘤活性以及抗感染的重要作用，但如持續(xù)釋放或釋放過多或與其它細胞因子關(guān)系失調(diào)，又會引起機體的發(fā)熱等，而參與疾病的發(fā)病機制。TNF－α可由多種組織細胞產(chǎn)生，其中脂肪細胞是其重要來源。研究證實，TNF－αmRNA在2型糖尿病患者脂肪組織中高表達，這些患者血漿TNF－α水平也明顯升高。在肥胖或糖尿病小鼠脂肪組織中，TNF－αmRNA也是高表達。提示TNF－α可能與胰島素抵抗密切相關(guān)。進一步研究表明，TNF－α對胰島素信號通路的調(diào)節(jié)起著重要作用。TNF－α通過抑制肌肉、脂肪細胞胰島素受體底物的酪氨酸磷酸化，使PI3K表達下調(diào)，影響下游GLUT4蛋白的表達與向細胞膜轉(zhuǎn)位，進而導致IR［1］。此外［2］，TNF－α還能通過激活核因子κβ抑制物激酶（IKK）β，誘導氧化應激等多種途徑誘發(fā)IR。

3 T3－L1細胞為源于Swiss小鼠胚胎成纖維細胞的細胞系，將其誘導為成熟脂肪細胞的方案是目前較為理想的方案之一。該方案可避免原代脂肪細胞取材不易、純度不一、生存能力差及實驗結(jié)果不穩(wěn)定等缺點。目前構(gòu)建胰島素抵抗模型多采用高糖高胰島素、地塞米松、游離脂肪酸等［3］藥物與細胞共孵育。本實驗采用TNF－α作為誘導劑，是為了模擬機體胰島素抵抗狀態(tài)下輕度炎癥的狀態(tài)。采用細胞水平評價胰島素抵抗的金標準：3H葡萄糖攝取實驗作為主要方法，證實TNF－α能顯著降低胰島素刺激的葡萄糖攝取，從而使成熟脂肪細胞產(chǎn)生胰島素抵抗。該方法簡便易行、數(shù)據(jù)可靠、重復性好，為研究胰島素抵抗提供了可靠的細胞模型。

［1］ Valverde AM，Benito M，Lorenzo M．The brown adipose cell：a model for understanding the molecular mechanisms of insulin resistance［J］．Acta Physiol Scand，2005，138：59－73．

［2］ Mlinar B，Marc J，Janez A，et al．Molecular mechanisms of insulin resistance and associated diseases［J］．Clin Chim Acta，2007，375：20－35．

［3］ Dandona P．Insulin resistance and endothelial dysfunction in atherosclerosis：implications and interventions［J］．Diabetes Technol Ther，2002，4（6）：809－815．