大鼠非手術(shù)人工授精方法的探析

李井春，郭會(huì)彥，齊永生，李雁冰，舟橋弘晃

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省大慶市銀浪牧場；3.日本岡山大學(xué)大學(xué)院自然科學(xué)研究科）

大鼠非手術(shù)人工授精法是指通過使用陰道窺視鏡及微型輸精器將精液注入到大鼠子宮內(nèi)的過程。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人工授精技術(shù)研究的深入開展，不僅克服了傳統(tǒng)手術(shù)的方法進(jìn)行人工授精時(shí)的不利影響，也為大鼠乃至其他小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的繁育提供了有力的手段[1]。目前，該項(xiàng)技術(shù)在國外已日趨成熟，并得到廣泛應(yīng)用，但在國內(nèi)還沒有關(guān)于這種方法的報(bào)道。

隨著胚胎工程技術(shù)的發(fā)展，如核移植、精子載體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)時(shí)，最終要利用胚胎移植、人工授精的技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物的繁殖。采用何種人工授精、胚胎移植的方法至關(guān)重要，目前，對(duì)于大鼠進(jìn)行人工授精、胚胎移植常采用手術(shù)的方法，但手術(shù)的方法存在一定的弊端，如在手術(shù)的，如果不當(dāng)，易發(fā)生感染，輕則影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，嚴(yán)重導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡；手術(shù)法給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來痛苦；還有手術(shù)法操作復(fù)雜，價(jià)格較高，而且要求操作者具有一定的外科手術(shù)的技術(shù)知識(shí)；此外，手術(shù)方法的人工授精的受胎率并不理想。

大鼠非手術(shù)人工授精法針對(duì)手術(shù)法的不足，首先從動(dòng)物福利學(xué)的角度上，不用手術(shù)，所以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒有痛苦；從操作技術(shù)角度上，操作簡單、易行沒有復(fù)雜的技術(shù)要求，更不需要具有外科手術(shù)技術(shù)知識(shí)；從大鼠生理特點(diǎn)上，輸精從子宮頸口插入更接近于自然交配方式，沒有創(chuàng)口，就談不到感染，有利于提高大鼠受胎率，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的繁殖效率。

1 大鼠非手術(shù)人工授精的方法及技術(shù)程序

完整的非手術(shù)大鼠人工授精技術(shù)包括假孕鼠的制備、精液的準(zhǔn)備、精子獲能、非手術(shù)輸精法，胚胎著床點(diǎn)及受胎率的檢查等技術(shù)。

1.1 假孕母鼠的制備

選用雌性Wister 系大鼠（8～18 周齡），通過陰道分泌物涂片法鑒定大鼠發(fā)情狀態(tài)，在午后6 點(diǎn)左右將處于發(fā)情前期的大鼠挑選出來，在20：30～21：00時(shí)利用玻璃震動(dòng)棒誘導(dǎo)假孕，隨后用于人工授精。

1.2 大鼠精液的準(zhǔn)備

精子的獲取和培養(yǎng)。取3月齡以上有繁育能力的雄鼠，頸椎脫臼處死，腹部75%酒精消毒，打開腹腔，取附睪尾。用眼科剪小心將附睪尾周圍的脂肪剝離，在滅菌濾紙上去除血跡和脂肪，將剪下的附睪放入預(yù)先在培養(yǎng)箱中與平衡的培養(yǎng)液（mKRB 液）中，再用眼科剪在附睪尾上剪6～8 個(gè)小口，可見有乳白色精子團(tuán)涌出，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 分鐘，用穿刺針挑出附睪組織塊，使精液充分混合，取10 微升精液，檢查精子密度，調(diào)整精子濃度，使精子濃度達(dá)1.0×107個(gè)·mL-1，在培養(yǎng)條件為5%的CO2、95%空氣、飽和濕度和37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h，使精子獲能，待用。

1.3 非手術(shù)人工輸精方法

1.3.1 非手術(shù)人工授精法，包括兩步操作：一步利用顯微放大觀察裝置，觀察子宮頸口位置，第二步利用微型輸精裝置插入子宮頸伸入子宮角，輸精。所述的顯微放大觀察裝置為檢耳鏡。通過這種裝置觀察子宮頸的準(zhǔn)確的位置，有利于輸精、受精卵器的槍頭準(zhǔn)確插入子宮頸口。所述的微型輸精的裝置，包括22 G平口注射針和1 mL 注射器（裝置示意圖見圖1）。

1.3.2 輸精方法：使用時(shí)，根據(jù)大鼠陰道的特點(diǎn)，選擇長2～3 cm、內(nèi)徑為3～5 mm 的檢耳鏡探頭，將雌性大鼠吸入式麻醉后，將檢耳手術(shù)鏡探頭插入陰道直到觀察到子宮頸口的位置，根據(jù)子宮頸的特點(diǎn)，分為左右兩個(gè)子宮角。如果向右側(cè)子宮角輸精時(shí)，輸精的具體操作見圖2 和圖3，將輸精器的尖部順著子宮頸口插入子宮角中部時(shí)，推進(jìn)輸精器內(nèi)的精液注入子宮角內(nèi)（輸精量每側(cè)子宮角一般為0.1 mL），這樣就簡單、快速的完成人工授精操作過程。輸精后待大鼠蘇醒后放到鼠籠中飼養(yǎng)。

圖1 非手術(shù)法人工授精利用的裝置Fig.1 The device of artificial insemination with non-surgery method

圖2 非手術(shù)法人工授精過程示意圖Fig.2 The sketch map of artificial insemination with non-surgery method

圖3 非手術(shù)法人工授精的過程圖Fig.3 The process map of artificial insemination with non- surgery method

1.4 母鼠胎兒著床點(diǎn)及妊娠率的檢查

大鼠的人工授精后如果受孕，大約22 d 后可以剖宮產(chǎn)確認(rèn)著床痕及胎兒數(shù)，計(jì)算大鼠人工授精的受胎率和產(chǎn)仔率，此實(shí)驗(yàn)方法得到的大鼠的妊娠率為80%左右（24 只妊娠/30 只大鼠）。

2 總結(jié)與前景展望

大鼠是僅次于小鼠的重要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在過去一個(gè)世紀(jì)中，它一直是首選的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，被廣泛地用于生物醫(yī)學(xué)研究[2]。大鼠人工授精技術(shù)的發(fā)展，為各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物的生產(chǎn)、胚胎移植、克隆及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展提供基礎(chǔ)的技術(shù)支持。大鼠非手術(shù)法人工授精對(duì)于某些突變品系大鼠的繁殖與品種改良有著特別重要的意義，并為受精、著床和胚胎發(fā)育等基礎(chǔ)理論研究提供了重要的技術(shù)手段[4-5]。

此外，有報(bào)道稱在使用冷凍精液非手術(shù)法人工授精時(shí)，在輸精前2～3 分鐘在腹部兩側(cè)分別注入1/400IU 的催產(chǎn)素（OXT），然后再進(jìn)行人工輸精，取得較高的分娩率和產(chǎn)仔率[3]（注射OXT 的分娩率為58.3%，沒有注射OXT 的分娩率為7.7%）。

雖然大鼠非手術(shù)人工授精技術(shù)尚不夠完善，還存在受孕率偏低、單側(cè)子宮角受孕率低等一系列問題[6-7]。隨著研究的不斷深入，這些問題終究會(huì)得到更好的解決，以期為人類實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。

［1］錢松明，牧佐渭，戴麗軍.實(shí)驗(yàn)小鼠的人工授精術(shù)［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)專輯，1981，1（1）：22-24.

［2］Yasunari Seita，Shuhei Sugio，Junya Ito，et al.Generation of live rats produced by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa ［J］.Biology of reproduction，2009，80：503-510.

［3］Nakatsukasa E，Inomata T，Ikeda T，et al.Generation of live rat offspring by intrauterine insemination with epididymal spermatozoa cryopreserved at -196 ℃［J］.Reproduction，2001，122：463-467.

［4］張燕林，顏阿林，吳曉云，等.倉鼠用作人工授精動(dòng)物模型的探索［J］.生殖與避孕，1993 ，13（6）：467-468.

［5］宋世鈞，鄭繼奎，鄭海洪，等.實(shí)驗(yàn)用小鼠的人工授精技術(shù)研究［J］.黑龍江動(dòng)物繁殖，2000，8（3）：4-5.

［6］白琴華.小鼠人工授精的初步研究［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，1986（4）：33-34.

［7］齊艷萍，劉勝軍，孫先宇.影響種鵝繁殖性狀的主要因素及應(yīng)對(duì)措施［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，24（4）：18-20.