雄黃微生物浸提液穩(wěn)定性研究

張爽，晏磊，崔玉東，馮丹丹，孫振宇

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

雄黃本身是一種硫化物類礦石，歷史十分悠久，因其能夠治療鼠瘺惡瘡、疽痔死肌等疾病而在《神農(nóng)本草經(jīng)》上有記載[1]。近年發(fā)現(xiàn)砷劑可以促進白血病細胞凋亡[2-3]，因而引起學(xué)術(shù)界對含砷中藥的高度關(guān)注。雄黃的主要成分為不溶于水的硫化砷，還含少量的可溶性砷及其他礦物元素[4]。雄黃的臨床運用主要以傳統(tǒng)的水飛形式，炮制效率低，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此，實驗引入微生物冶金的成熟技術(shù)，利用氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillμs ferrooxidans，A.f）進行生物炮制[5]。A.f 能夠吸附到各種硫化礦表面，并能以其中的低價態(tài)的硫作為生長能源物質(zhì)，將礦物中藥雄黃進行微生物的氧化、浸提[6]。

光、熱、氧氣、pH 及輔料等都會影響藥物的穩(wěn)定性，任何一個藥物制劑產(chǎn)品都應(yīng)在所要求的貯藏條件下，藥物含量或效價都應(yīng)保持在標準要求的限度以上[7-8]。穩(wěn)定性試驗的目的是考察原料或藥物制劑在溫度、濕度、光線的影響下隨時間的變化規(guī)律，為對處方組成、制劑工藝、輔料和穩(wěn)定性附加劑的選用和合適的包裝設(shè)計提供科學(xué)依據(jù)，同時通過試驗建立藥品的有效期。因此，為了增加雄黃在臨床上的應(yīng)用率，對雄黃微生物浸提液的穩(wěn)定性進行研究。

1 儀器和材料

儀器 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海賽歐試驗設(shè)備有限公司）；250D 光照培養(yǎng)箱（杭州藍天化驗儀器廠）；pH S-3C pH 計（意大利哈納）；IRIS Advantage ER/S 型電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（Thermo Jarrell Ash）；YXQ 型XG46-280S 手提式高壓蒸汽滅菌鍋（上海迅博公司）。

材料 雄黃微生物浸提液；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na，AR，北京化工廠）；亞硫酸氫鈉（NaHSO3，AR，浙江省永嘉縣化工試劑廠）；重蒸水（自制）。

2 實驗方法

2.1 菌株及培養(yǎng)基

A.f 菌株購自美國ATCC，培養(yǎng)基的制備參照Yan 等的方法進行[9]。

2.2 雄黃微生物浸提液制備

雄黃微生物浸提液的制備參照Chen 等的方法進行[1]。

2.3 雄黃微生物浸提液穩(wěn)定性試驗

2.3.1 雄黃微生物浸提液高溫穩(wěn)定性考察

取雄黃微生物浸提液3 批，置60 ℃條件下進行10 d 高溫穩(wěn)定性試驗，分別于0、5、10 d 取樣[4]。以雄黃浸提液的色澤、溶解情況、pH 值及砷含量為指標，對雄黃微生物浸提液穩(wěn)定性進行考察。

2.3.2 雄黃微生物浸提液光照穩(wěn)定性考察

取雄黃微生物浸提液3 批，置照度為4 500±500 lx 條件下放置10 d，分別于0、5、10 d 取樣[4]。以雄黃浸提液的溶解情況、色澤、pH 值及砷含量為指標，對雄黃微生物浸提液穩(wěn)定性進行考察。

2.4 抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用對雄黃微生物浸提液穩(wěn)定性的影響

2.4.1 雄黃微生物浸提液高溫穩(wěn)定性考察

取雄黃微生物浸提液3 批，分別按0.03%和0.15%的比例添加EDTA-2Na 和NaHSO3，用0.1M NaOH 調(diào)pH 至7.0 后，置于60 ℃條件下進行10 d高溫穩(wěn)定性試驗，分別于0、5、10 d 取樣。以雄黃浸提液的溶解情況、色澤、pH 值以及砷含量為指標，對雄黃微生物浸提液穩(wěn)定性進行考察。

2.4.2 雄黃微生物浸提液光照穩(wěn)定性考察

取雄黃微生物浸提液3 批，分別按0.03%和0.15%的比例添加EDTA-2Na 和NaHSO3，用0.1M NaOH 調(diào)pH 至7.0 后，置于照度為4 500±500 lx 條件下放置10 d，分別于0、5、10 d 取樣。以雄黃浸提液的溶解情況、色澤、pH 值以及砷含量為指標，對雄黃微生物浸提液穩(wěn)定性進行考察。

2.5 pH 對雄黃微生物浸提液的影響

取雄黃微生物浸提液3 批，分別按0.03%和0.15%的比例添加EDTA-2Na 和NaHSO3，并分別調(diào)節(jié)pH 值至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0（EDTA-2Na）。將處理好的浸提液均分成2 份，其中1 份置60 ℃條件下進行10 d 高溫穩(wěn)定性試驗，另1 份置照度為4 500±500 lx 條件下放置10 d。分別于0、5、10 d 取樣，以雄黃浸提液的溶解情況、色澤、pH 值以及砷含量為指標，對雄黃微生物浸提液穩(wěn)定性進行考察。

3 實驗結(jié)果

3.1 雄黃微生物浸提液高溫穩(wěn)定性實驗結(jié)果

雄黃微生物浸提液經(jīng)第0、5、10 d 取樣分析。分析表明：3 批雄黃微生物浸提液的色澤、pH 值無明顯變化（見圖1），但瓶底有稍許沉淀，使溶液中砷含量降低（見圖2）。

圖1 雄黃微生物浸提液在60 ℃條件下pH 變化Fig.1 Variation of pH value for realgar bioleachate at 60 ℃

圖2 雄黃微生物浸提液在60 ℃條件下砷含量變化Fig.2 Variation of arsenic content for realgar bioleachate at 60 ℃

3.2 雄黃微生物浸提液光照穩(wěn)定性實驗結(jié)果

雄黃微生物浸提液經(jīng)第0、5、10 d 取樣分析。分析表明：3 批雄黃微生物浸提液色澤、pH 值無明顯變化（見圖3），瓶底有少量沉淀，使浸提液中砷含量降低（見圖4）。

圖3 雄黃微生物浸提液在光照條件下pH 變化Fig.3 Vaiation of pH value for bioleachate at strong light

圖4 雄黃微生物浸提液在光照條件下砷含量變化Fig.4 Variation of arsenic content for bioleachate at strong light

3.3 抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用對雄黃微生物浸提液高溫穩(wěn)定性實驗結(jié)果

雄黃微生物浸提液經(jīng)第0、5、10 d 取樣分析。分析表明：抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用后雄黃微生物浸提液澄清，色澤及砷含量（見表1）無明顯變化，pH 值呈下降趨勢（見圖5）。

表1 抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用對雄黃微生物浸提液在60 ℃放置10 d 的砷含量變化Table 1 Variation of arsenic content after laying up at 60 ℃for bioleachate by using antioxidant and chelating agents in 10 d

3.4 抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用對雄黃微生物浸提液光照穩(wěn)定性實驗結(jié)果

雄黃微生物浸提液經(jīng)第0、5、10 d 取樣分析。分析表明：抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用后雄黃微生物浸提液澄清，色澤及砷含量無明顯變化（見表2），pH 值呈下降趨勢（見圖6）。

圖5 抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用對雄黃微生物浸提液在60 ℃放置10 d 的pH 變化Fig.5 Variation of pH value after laying up at 60 ℃for bioleachate by using antioxidant and chelating agents in 10 d

表2 抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用對雄黃微生物浸提液在光照條件下放置10 d 的砷含量變化Table 2 Variation of arsenic content after laying up at strong light for bioleachate by using antioxidant and chelating agents in 10 d

圖6 抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用對雄黃微生物浸提液在4 500±500 lx 放置10 d 的pH 變化Fig.6 Variation of pH value after laying up at 4 500±500 lx for bioleachate by using antioxidant and chelating agents in 10 d

3.5 pH 對雄黃微生物浸提液的影響

雄黃微生物浸提液經(jīng)第0、5、10 d 取樣分析，抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用后，調(diào)整浸提液pH 值，雄黃微生物浸提液澄清，色澤及砷含量（見表3、表4）無明顯變化，pH 值變化見圖7、圖8。

圖7 高溫對雄黃浸提液pH 的影響Fig.7 Effect of high temperature on pH of bioleachate

圖8 光照對雄黃浸提液pH 的影響Fig.8 Effect of strong light on pH of bioleachate

表3 抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用對雄黃微生物浸提液在60 ℃放置10 d 的砷含量變化Table 3 Variation of arsenic content after laying up at 60 ℃for bioleachate by using antioxidant and chelating agents in 10 d

表4 抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用對雄黃微生物浸提液在光照條件下放置10 d 的砷含量變化Table 4 Variation of arsenic content after laying up at strong light for bioleachate by using antioxidant and chelating agents in 10 d

4 討論

在A.f 浸提雄黃過程中，A.f 以硫酸亞鐵作為能源生長，所以雄黃微生物浸提液中含有三價鐵離子。當未加輔料的雄黃微生物浸提液經(jīng)過高溫處理時，高溫和光照處理導(dǎo)致三價鐵同溶液中的鈉離子、銨離子以及鉀離子發(fā)生反應(yīng)形成黃鉀鐵釩沉淀，該沉淀可吸附溶液中的砷[1]，導(dǎo)致浸提液砷含量出現(xiàn)了明顯的下降（見圖2、圖4），表明雄黃微生物浸提液不穩(wěn)定。

為了增加雄黃微生物浸提液的穩(wěn)定性，我們向雄黃微生物浸提液中加入了抗氧劑和螯合劑。經(jīng)過高溫或光照處理，浸提液的色澤和砷含量無顯著變化（見表1、表2），表明加入輔料后，雄黃微生物浸提液穩(wěn)定性明顯增強。這主要是由于三價鐵被加入的螯合劑螯合，而抗氧劑能使浸提液中氧含量保持在一個較低的水平。然而，加入抗氧劑和螯合劑后，浸提液的pH 值出現(xiàn)了明顯的降低，作為開發(fā)雄黃注射劑的原料藥，其pH 必須控制在4.0～9.0 間。鑒于此，我們利用EDTA-2Na 調(diào)節(jié)浸提液的酸堿度后，經(jīng)過高溫或光照處理，結(jié)果表明，浸提液的色澤、砷含量及pH 值均無明顯變化（見表3、表4、圖7、圖8），說明加入上述輔料可獲得穩(wěn)定性良好的雄黃微生物浸提液。

5 結(jié)論

（1）雄黃微生物浸提液在60 ℃及4 500±500 lx條件下不穩(wěn)定，在生產(chǎn)、科研及儲藏過程中應(yīng)低溫并且避光保存。

（2）螯合劑乙二胺四乙酸二鈉和抗氧劑亞硫酸氫鈉聯(lián)合作用于雄黃浸提液，經(jīng)高溫、光照處理后，浸提液色澤及砷含量無明顯改變，說明抗氧劑與螯合劑聯(lián)合應(yīng)用后，對控制雄黃微生物浸提液的穩(wěn)定起到積極作用，但浸提液的pH 值出現(xiàn)明顯下降，繼續(xù)加入EDTA-2Na 后，浸提液的pH 值得到了有效控制。

［1］Peng Chen，Lei Yan，F(xiàn)eifan Leng，et al.Bioleaching of realgar by Acidithiobacillus ferrooxidans using ferrous iron and elemental sulfur as the sole and mixed energy sources［J］.Bioresour.Technol，2011，102（3）：3260-3267.

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［3］寧凝，彭作富，袁蘭，等.雄黃納米微粒對于白血病細胞的誘導(dǎo)凋亡及壞死作用［J］.中國中藥雜志，2005，30（2）：136-140.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005.

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［6］Peng chen，Lei Yan，Qiang Wang，et al.Surface alteration of realgar （As4S4）by Acidithiobacillus ferrooxidans［J］.International Microbiology，2012，15：9-15.

［7］國家食品藥品監(jiān)督管理局.國食藥監(jiān)注［2007］743 中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求［S］.2007.

［8］崔福德.藥劑學(xué)［M］.5 版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009.

［9］晏磊，張爽，李雪，等.氧化亞鐵硫桿菌的磁性及鐵源種類對磁小體合成的影響［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2012，24（1）：23-27.