6個(gè)中藥單體對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW620體外增殖活性的影響

張敏，葉春，曹錄秀，盛艷梅

（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610083）

結(jié)腸癌（colon cancer，CC）指發(fā)生在盲腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸的惡性癌瘤。近年來(lái)，隨著生活水平的提高、生活習(xí)慣的改變，結(jié)腸癌在我國(guó)的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，在消化道腫瘤中已僅次于胃癌，位居第2?？鄥?、三七、大黃是中醫(yī)臨床用于治療CC的經(jīng)驗(yàn)方中的三味常用中藥，據(jù)文獻(xiàn)［1－3］報(bào)道，三味藥材中的化學(xué)成分具有一定的抗腫瘤活性。

為進(jìn)一步研究其對(duì)結(jié)腸癌的作用及物質(zhì)基礎(chǔ)，以篩選抗癌療效確切的組分配伍新方，本文擬對(duì)三味中藥中多個(gè)單體成分的體外抗癌活性進(jìn)行對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 結(jié)腸腺癌細(xì)胞株SW620（購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。

1.1.2 藥品與試劑 苦參堿（XC071201）、氧化苦參堿（XC071212）購(gòu)自西安小草生物技術(shù)有限公司，大黃 素 （MUST－11042601）、蘆 薈 大 黃 素 （MUST－10112301）、人參皂苷Rh2（MUST－09071501）、人參皂苷Rg1（MUST－11041201）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclon公司）、胰蛋白酶（GIBCO公司），MTT、DMSO（均購(gòu)自Sigma公司），胎牛血清（PAA），其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 倒置相差顯微鏡（Olympus IX70，Japan）、CO2孵箱（Thermo 3111）、超凈工作臺(tái)（SW－CJ－2FD，蘇 州 凈 化 公 司，中 國(guó) ）、超 純 水 儀（Millipore）、酶標(biāo)儀（Multiskan MK3）等。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 稱取適量苦參堿、氧化苦參堿、大黃素、蘆薈大黃素、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rg1，均用無(wú)血清培養(yǎng)基溶解成相應(yīng)濃度，過(guò)濾除菌備用。

1.2.2 細(xì)胞接種培養(yǎng)［1］取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后吸管吹打使之分散均勻制成單細(xì)胞懸液，按1×105個(gè)／mL細(xì)胞，100μL／孔接種于96孔培養(yǎng)板中，分別加入相同體積的各不同濃度受試藥液，同時(shí)加入適量完全培養(yǎng)液（900mL／L DMEM培養(yǎng)基，100 mL／L胎牛血清，青霉素1×105U／L，鏈霉素1×105U／L）補(bǔ)足，終體積為200μL／孔（每組6個(gè)復(fù)孔），同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h。

1.2.3 MTT 微量比色法檢測(cè)［4］培養(yǎng)結(jié)束前加入MTT液50μL／孔繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL／孔，充分振蕩，室溫靜置10min，用酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收值A(chǔ)，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率 （%）＝ （1－藥物組A值／對(duì)照組A值）×100%。期間每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（ONE WAY ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。?

圖1 對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24h（×200）圖2給藥組細(xì)胞培養(yǎng)24h（×200）圖3 對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)48h（×200）圖4 給藥組細(xì)胞培養(yǎng)48h（×200）圖5 對(duì)照組MTT染色（×200）圖6 給藥組MTT染色（×200）

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)約2h開(kāi)始貼壁，貼壁后的細(xì)胞基本呈圓形。12～24h細(xì)胞開(kāi)始伸出長(zhǎng)短不等的細(xì)小突起，細(xì)胞多呈梭形。48h后正常組梭形細(xì)胞數(shù)明顯增加，給藥組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變差，且細(xì)胞數(shù)目未見(jiàn)明顯增加。MTT作用4h后，可見(jiàn)給藥組細(xì)胞形成結(jié)晶數(shù)較正常對(duì)照組明顯減少（見(jiàn)圖1～6）。

2.2 各成分對(duì)細(xì)胞體外增殖活性的影響

MTT微量比色法檢測(cè)得到5個(gè)不同濃度的6個(gè)成分分別作用24、48h后的吸收值A(chǔ)（其大小能反映活細(xì)胞數(shù)量），并按公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

作用24、48h后，苦參堿、氧化苦參堿各濃度均能明顯抑制體外培養(yǎng)的SW620結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，且呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性（見(jiàn)圖7）。

作用24、48h后，人參皂苷Rh2和人參皂苷Rg1各濃度均能顯著抑制體外培養(yǎng)的SW620結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，其中人參皂苷Rh2隨濃度增加，對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制率亦增強(qiáng)，呈劑量和時(shí)間依賴性（見(jiàn)圖8）。

作用24、48h后，大黃素、蘆薈大黃素較高濃度均能顯著抑制SW620結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性（見(jiàn)圖9）。

圖8 人參皂苷Rh2、Rg1對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率

圖9 大黃素和蘆薈大黃素對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為CC的病因病機(jī)，局部屬“毒、瘀”，整體為“虛”，以毒邪蘊(yùn)結(jié)結(jié)腸為中心，痰濕瘀血互積助長(zhǎng)其形，臟腑氣血耗傷為本。根據(jù)對(duì)CC“毒、瘀、虛”病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)，中醫(yī)采用扶正固本、清熱解毒、清熱燥濕、活血化瘀等治法，選擇中藥組成復(fù)方?？鄥ⅰ⑷?、大黃為郭子光教授主編《現(xiàn)代中醫(yī)治療學(xué)》中所載灌腸治療CC經(jīng)驗(yàn)方中的主藥，苦參清除蘊(yùn)結(jié)結(jié)腸之濕熱毒邪，三七去除結(jié)腸局部瘀血而止血，又兼扶正之效，大黃能疏導(dǎo)結(jié)腸之濕熱、食毒等毒邪。三藥合用，主要針對(duì)CC患者癌變局部“毒、瘀”的基本病機(jī)，可起祛除蘊(yùn)結(jié)結(jié)腸之諸毒邪、瘀滯，緩解便膿血、腸梗阻、腹痛、腹瀉等并發(fā)癥，提高患者生存質(zhì)量。

該方三味中藥中苦參堿、氧化苦參堿、蘆薈大黃素、人參皂苷 Rh2等成分已有文獻(xiàn)［2，3，5］報(bào)道其抗癌活性及作用機(jī)制。本文為進(jìn)一步研究其對(duì)結(jié)腸癌的作用及物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)這些成分進(jìn)行了抗癌活性對(duì)比研究。結(jié)果表明，單體苦參堿、氧化苦參堿、大黃素、蘆薈大黃素、人參皂苷Rh2、Rg1在不同濃度下均表現(xiàn)出一定的抑制SW620結(jié)腸癌細(xì)胞體外增殖的作用，其中尤以蘆薈大黃素最顯著，且表現(xiàn)出良好的量效和時(shí)效關(guān)系。課題組將選取活性較強(qiáng)的單體成分組成配伍復(fù)方進(jìn)行抗癌活性研究，以期得到療效確切的抗結(jié)腸癌新復(fù)方。

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［5］梁磊，王曉燕，張緒慧，等.苦豆子生物堿抗結(jié)腸腺癌細(xì)胞株SW620的作用篩選［J］.中藥材，2008，31（6）：866－869.