等位基因特異性PCR及MLPA檢測CMT患者PMP22突變基因的結(jié)果比較

史 磊，曹秉振

(遼寧醫(yī)學院濟南軍區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，濟南250031)

腓骨肌萎縮癥即 Charcot-Marie-Tooth病(CMT)，是一組由不同致病基因引起的臨床表型基本相似的周圍神經(jīng)單基因遺傳病，其主要特征為慢性進行性加重的肢體遠端無力、肌萎縮和感覺損害［1］。CMT的遺傳方式主要為常染色體顯性遺傳(AD)，也可見常染色體隱性遺傳(AR)及X連鎖顯性或隱性遺傳(XD或XR)。最常見的類型為CMT1型，其中50% ～70%的CMT1患者及90%的散發(fā)病例為CMT1A型［2］，多由17號染色體短臂11.2區(qū)(17p11.2)包含周圍髓鞘蛋白PMP22基因在內(nèi)的1.5 Mb的正向串聯(lián)重復突變所致。目前，有效檢測短片段重復突變的實驗方法主要有實時熒光定量PCR、等位基因特異性PCR-雙酶切、短串聯(lián)重復序列分析(STR)、多重連接探針擴增技術(shù)(MLPA)等。等位基因特異性PCR具有操作簡便，對操作條件要求較低等優(yōu)點，但其靈敏度與可靠性有待進一步驗證，且人為因素影響較大。MLPA技術(shù)是近年發(fā)展起來的一項新的基因定量技術(shù)，可同時對多基因多外顯子進行重復、缺失及定量分析，且已開發(fā)出特異的CMT1型試劑盒，操作方便，靈敏度高。我們于2012年3～8月進行本研究，初步探討等位基因特異性PCR及MLPA兩種方法對PMP22基因重復突變檢測的一致性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 CMT患者6例，均來源于近2年來就診于濟南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的散發(fā)病例，所有病例診斷均符合Harding于1980年制定的診斷標準［3］。正常對照為健康成人6例，均無肢體無力、肌萎縮及遺傳病家族史。所有受試者征得本人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集與處理 抽取患者及健康對照外周靜脈血3～5 mL，用EDTA抗凝，Promega試劑盒提取全血標本基因組DNA。

1.2.2 等位基因特異PCR引物設(shè)計與合成 在PMP22基因重復片段遠端和近端CMT1A-REP區(qū)域內(nèi)設(shè)計兩對引物，分別為 F1、R1、F2、R2，引物 F1與R1、F2與R2可擴增出患者與正常人均有的遠端和近端正常存在的2片段，而F1與R2可擴增出特異性重復連接片段［4］，引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PMP22等位基因特異PCR引物序列表

1.2.3 PCR反應及條件 反應體系:總體積25 μL，其中 dNTP Mixture(2 mmol/L)2.5 μL，10 ×PCR buffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶 0.125 U，基因組DNA 1 μL，上下游引物(5 μmol/L)各 2.5 μL，三蒸水13.875 μL。反應條件為在 GeneAmp PCR system 2400熱循環(huán)儀上94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s，56 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 3 min，25 次循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4℃保存。反應完成后取5 μL PCR 產(chǎn)物與1 μL 溴乙錠混合，0.8%瓊脂糖凝膠電泳(加核酸染色液)檢測產(chǎn)物。

1.2.4 MLPA檢測 MLPA檢測試劑盒 SALSA P033購自MRC-Holland，具體操作過程如下:①DNA定量及變性:取基因組DNA 1 μL，加TE稀釋至5 μL，在熱循環(huán)儀上98℃變性5 min后冷卻至25℃。SALSA MLPA 探針雜交:分別加入 1.5 μL P033 探針混合物及1.5 μL MLPA buffer，小心混勻后 95 ℃變性1 min，60℃下雜交16～20 h。②連接及擴增:雜交后在54℃下加入連接混合物(25 μL三蒸水、3 μL連接緩沖液 A、3 μL 連接緩沖液 B、1 μL 連接酶)孵育15 min，然后98℃加熱5 min以滅活連接酶，待溫度降至20℃后，加入PCR反應混合物(7.5 μL 三蒸水、2 μL SALSA PCR 引物混合物、0.5 μL SALSA聚合酶)，PCR反應條件為95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次，72℃延伸20 min。③毛細管凝膠電泳檢測:取0.7 μL PCR反應產(chǎn)物加入0.2 μL LIZ-500標記物及9 μL甲酰胺(LIZ-500及甲酰胺均為美國ABI公司生產(chǎn))，80℃變性2 min后立即置冰架上冷卻，最后用毛細管凝膠電泳檢測(在ABI3130基因測序儀上進行)，程序結(jié)束后導出數(shù)據(jù)，結(jié)果用Coffalyser軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 等位基因特異性PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果 6例患者及6例健康對照均出現(xiàn)F1與R1、F2與R2引物擴增出來的正常條帶，均未出現(xiàn)F1與R2擴增的特異性短片段重復的異常條帶。

2.2 MLPA檢測分析 根據(jù)Coffalyser軟件說明，將各目的片段的峰面積除以全部內(nèi)參照峰面積之和，所得該目的片段的峰面積比值，再將此峰面積比值除以相對應的正常外對照峰面積，所得比值即為拷貝數(shù)比值，從而可計算出目的片段的拷貝數(shù)。正常人該比值波動在0.7 ～1.3，1.7 ～2.3 為重復性患者［5］。運行軟件分析得出:6例患者及6例健康對照的PMP22基因全部在0.7～1.3，表明所有被檢測患者及對照的PMP22基因均未出現(xiàn)重復突變。

3 討論

CMT是一組臨床較多見的周圍神經(jīng)單基因遺傳病，最常見的是17號染色體短臂11.2區(qū)(17p11.2)正向串聯(lián)重復突變所導致的CMT1A型，此外還有40個其他不同的致病基因被定位［6］，這些基因可導致CMT2(軸突型)、CMT3、CMT4、CMTX、CMTDI等類型，所有類型的CMT患者的臨床表型基本相似。目前，該病的診斷主要依靠家族史、臨床表現(xiàn)、神經(jīng)電生理及周圍神經(jīng)活檢，致病基因的檢測應用較少，但其可以更進一步確診并明確該病的亞型，為臨床診斷提供更準確的依據(jù)。根據(jù)國內(nèi)外文獻的報道，PMP22基因重復突變所致CMT的患病率最高，所以本研究我們主要檢測了臨床搜集的CMT患者PMP22基因是否存在短片段重復突變。

等位基因特異性PCR是直接對PMP22基因交換熱點區(qū)設(shè)計引物擴增出特異性連接片段，再經(jīng)限制性酶切來驗證產(chǎn)物。Kon-Ping Lin等根據(jù)已被共識的近端和遠端CMT1A-REP序列設(shè)計出了PMP22等位基因特異性引物，共有4種擴增方式，擴增產(chǎn)物可進一步被EcoRI和NsiI兩種酶驗證［7］，由于我們的樣本均未擴增出異常的片段條帶，故無需用兩種酶進行驗證。該方法的應用現(xiàn)已比較成熟，其優(yōu)點是簡便易行，對操作條件及成本要求較低，但其靈敏度和準確性仍需進一步驗證，因此可作為臨床上基因篩查的第一步。而新技術(shù)MLPA-CMT1A試劑盒的探針基本覆蓋了PMP22基因外顯子的所有熱點區(qū)域，且能同時檢測基因的重復與缺失，敏感度及準確度較等位基因特異性PCR更高，且MLPA與熒光定量PCR、STR等方法相比也具有一定的優(yōu)勢:①可同時檢測多基因多外顯子的重復或缺失，②對DNA模板定量及純度要求較低。當然，MLPA也有自身的缺點和限制，比如價格稍昂貴、對實驗室的配置條件要求較高等。因此，兩種方法對特異性短片段重復突變的檢測都具有不可替代的作用和意義。在臨床患者初篩或基礎(chǔ)設(shè)施比較簡單的實驗室條件下，可以先采用等位基因特異性PCR進行檢測，對可疑陽性患者再進一步選擇靈敏度和準確度更高的ML-PA確定診斷。

本研究中對同一樣本同時應用了這兩種方法，目的是檢測兩種方法對于PMP22基因突變檢查的一致性，指導臨床建立基因篩查的程序。研究結(jié)果顯示，在6例CMT患者和6例正常對照中，兩種檢查手段都得出了陰性結(jié)果，提示兩種方法在檢測結(jié)果上的一致性。但由于本研究樣本數(shù)量較小，且缺少真正的短片段重復突變陽性結(jié)果，使得結(jié)論的說服性比較局限，故仍需擴大樣本量以進一步證實。另外CMT涉及致病基因很多，其臨床表型和基因類型缺乏一致性，陰性結(jié)果并不排除患者存在其他的基因異常，因此仍需要進一步基因檢查以明確致病基因。

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