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    一氧化氮對(duì)萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中部分物質(zhì)代謝的影響

    2013-08-02 00:52:10楊北寧張鳳芝蘇國(guó)興
    關(guān)鍵詞:水解酶萵苣硝普鈉

    楊北寧, 張鳳芝, 蘇國(guó)興

    (蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇 蘇州 215123)

    迄今為止,已有大量有關(guān)一氧化氮(NO)促進(jìn)植物種子萌發(fā)的報(bào)道[1]。Kopyra等在羽扇豆(Lupinus luteus)中發(fā)現(xiàn),一定濃度的NO供體硝普鈉(SNP)可提高種子萌發(fā)率,作用效果與時(shí)間有關(guān),48 h后SNP這種促進(jìn)萌發(fā)作用消失[2]。Lamatine等報(bào)道,在26℃條件下,SNP能夠明顯地促進(jìn)處于暗處的萵苣種子萌發(fā),而用NO清除劑cPTIO處理則可降低對(duì)萌發(fā)的促進(jìn)作用[3]。外源添加一定濃度SNP可明顯提高豌豆、黃瓜、玉米和刺槐種子的發(fā)芽率[4]。Sarath等證實(shí),NO供體SNP、亞鐵氰化鉀和CN-同樣可促進(jìn)2種溫季牧草種子的萌發(fā),并可被NO清除劑cPTIO抑制,而認(rèn)定在該種子萌發(fā)過(guò)程中有NO的產(chǎn)生[5]。近年來(lái),隨著NO在植物種子萌發(fā)和休眠中所起作用的確定,人們相繼展開(kāi)了NO促進(jìn)種子萌發(fā)和解除休眠的機(jī)理研究。如在擬南芥種子萌發(fā)過(guò)程中,證實(shí)NO的作用部位是糊粉層。在NO外源供體SNP誘導(dǎo)小麥種子萌發(fā)的研究中,發(fā)現(xiàn)種子的β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促進(jìn)[6]。然而,經(jīng)NO和NO合成抑制劑處理后,在種子萌發(fā)過(guò)程中,種子內(nèi)貯藏物質(zhì)含量的變化仍鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以萵苣種子為材料,研究NO供體硝普鈉(SNP)和NO生物合成抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對(duì)萵苣種子萌發(fā)時(shí)內(nèi)含物質(zhì)含量和水解酶活性的影響,為NO供體促進(jìn)萵苣種子萌發(fā)時(shí)物質(zhì)代謝變化的研究提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料及處理

    萵苣(Lactuca sativa L.)品種掛絲紅種子購(gòu)于四川省綿陽(yáng)市種都種業(yè)有限公司。所有藥品均購(gòu)自Sigma公司。

    萵苣種子先用0.5%的HgCl2消毒5 min,再用無(wú)菌水沖洗5次后,在22℃黑暗環(huán)境中用處理液浸種4 h,處理液濃度如下:(1)0 mmol/L(對(duì)照)、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L NO 供體 SNP;(2)1.00 mmol/L NO生物合成抑制劑L-NAME,所有處理液pH 5.8。選取飽滿(mǎn)的種子播種于含0.5%瓊脂的固體培養(yǎng)基上,22℃暗培養(yǎng)。每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

    1.2 測(cè)定方法

    用目測(cè)法(胚根突破種皮大于1 mm)測(cè)定0 mmol/L、0.05 mmol/L、0.10 mmol/L、0.20 mmol/L SNP處理48 h萵苣種子的萌發(fā)率及0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP和1.00 mmol/L L-NAME分別處理12 h、24 h、36 h、48 h、60 h 萵苣種子的種子萌發(fā)率。測(cè)定0 mmol/L、0.10 mmol/L SNP 和 1.00 mmol/L LNAME 分別處理12 h、24 h、36 h、48 h 萵苣種子內(nèi)含物質(zhì)含量和水解酶活性:粗脂肪索氏提取法測(cè)定粗脂肪含量[7];蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖和淀粉含量[8];考馬斯亮藍(lán) G250 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[8];3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定α-淀粉酶和β-淀粉酶活性[8];堿式滴定法測(cè)定脂肪酶活性[9];磺胺法測(cè)定硝酸還原酶活性[10]。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    使用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),用Duncan’s法比較差異顯著性。應(yīng)用EXCEL軟件進(jìn)行作圖。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度硝普鈉(SNP)對(duì)萵苣種子萌發(fā)的影響

    用不同濃度SNP處理萵苣種子36 h,種子的萌發(fā)率如圖1所示。SNP對(duì)萵苣種子的萌發(fā)表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用,在0~0.10 mmol/L濃度范圍內(nèi),種子萌發(fā)率隨SNP濃度的增加而升高,當(dāng)SNP濃度為0.10 mmol/L時(shí),種子萌發(fā)率最高;而當(dāng)SNP的濃度增至0.20 mmol/L時(shí),種子萌發(fā)受到明顯抑制。表明0.10 mmol/L SNP促進(jìn)萵苣種子萌發(fā)的效果最佳。

    圖1 不同濃度硝普鈉對(duì)萵苣種子萌發(fā)的影響Fig.1 The effect of different concentrations of SNP on the seed germination of lettuce

    2.2 0.10 mmol/L硝普鈉(SNP)和1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)對(duì)萵苣種子萌發(fā)的影響

    在浸種12~36 h,0.10 mmol/L SNP處理對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最為顯著,在浸種處理24 h和36 h時(shí),種子萌發(fā)率分別比對(duì)照增加26.5個(gè)百分點(diǎn)(P<0.05)和15.5個(gè)百分點(diǎn)(P<0.05),但浸種處理48 h后這種促進(jìn)作用逐漸減弱。1.00 mmol/L LNAME浸種則可顯著抑制種子的萌發(fā),在浸種36 h時(shí),萌發(fā)率僅28.1%(圖2)。

    圖2 0.10 mmol/L 硝普鈉和 1.00 mmol/L N-硝基-L-精氨酸甲酯對(duì)萵苣種子萌發(fā)的影響Fig.2 The effect of 0.10 mmol/L SNP and 1.00 mmol/L LNAME on the seed germination of lettuce

    2.3 硝普鈉(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)對(duì)萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)含量的影響

    如表1所示,0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的粗脂肪含量和蛋白質(zhì)含量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,與0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)相比,差異均不顯著(P>0.05));0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的淀粉含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,均顯著低于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P<0.05);0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的可溶性糖含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P<0.05)。

    表1 0.10 mmol/L SNP對(duì)萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)含量的影響Table 1 The effects of 0.10 mmol/L SNP on some substance contents of lettuce during seed germination

    如表2所示,1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的蛋白質(zhì)含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,與0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)相比,差異均不顯著(P>0.05);1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的粗脂肪含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,處理36 h和48 h的粗脂肪含量均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P<0.05);1.00 mmol/L L-NAME處理下萵苣種子的淀粉含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降,均顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P<0.05);0.10 mmol/L SNP處理下萵苣種子的可溶性糖含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,均顯著低于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P<0.05)。

    表2 1.00 mmol/L L-NAME對(duì)萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)含量的影響Table 2 The effects of 1.00 mmol/L L-NAME on some substance contents during lettuce seed germination

    2.4 硝普鈉(SNP)和 N-硝基-L-精氨酸甲酯(LNAME)處理后部分水解酶活性的變化

    如圖3所示,不同處理下萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中α-淀粉酶活性均隨種子處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,其中0.10 mmol/L SNP處理的α-淀粉酶活性顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P<0.05);0 mmol/L SNP處理下β-淀粉酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),在處理36 h時(shí)β-淀粉酶活性均達(dá)到最高峰,0.10 mmol/L SNP處理的β-淀粉酶活性顯著高于0 mmol/L SNP處理(對(duì)照)(P<0.05);不同處理下萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中脂肪水解酶活性均隨種子處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,在浸種12~48 h 0.10 mmol/L SNP處理的種子脂肪水解酶活性均顯著高于0 mmol/L SNP(對(duì)照)處理(P<0.05);不同處理下萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中硝酸還原酶活性均隨種子處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,在浸種12~36 h 0.10 mmol/L SNP處理的種子硝酸還原酶活性均顯著高于0 mmol/L SNP(對(duì)照)處理(P<0.05)。在浸種12~36 h 1.00 mmol/L L-NAME處理的 α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶、硝酸還原酶的活性均顯著低于0 mmol/L SNP(對(duì)照)和0.10 mmol/L SNP處理(P <0.05)。

    圖3 萵苣種子萌發(fā)過(guò)程中部分水解酶活性的變化Fig.3 The changes of some hydrolases activities during seed germination of lettuce

    3 討論

    一氧化氮在植物體的多種生理過(guò)程中有重要作用。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,0 mmol/L、0.05 mmol/L和0.10 mmol/L硝普鈉(SNP)對(duì)萵苣種子的萌發(fā)表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用,其中0.10 mmol/L硝普鈉的促進(jìn)作用好于其他2種處理,當(dāng)SNP濃度上升到0.20 mmol/L時(shí)種子萌發(fā)受到顯著抑制;在浸種12~36 h,0.10 mmol/L SNP對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用最為顯著,48 h后作用消失。這與白旭等[10]關(guān)于SNP促進(jìn)萵苣種子萌發(fā)的研究結(jié)果相一致。

    Bethke等指出,NO促進(jìn)種子的萌發(fā)可能與種子對(duì)脫落酸和赤霉素的敏感性改變有關(guān)[11],而ABA和GA與種子水解酶的誘導(dǎo)合成和活性調(diào)節(jié)有關(guān)。孫永剛等在NO外源供體SNP誘導(dǎo)小麥種子萌發(fā)的研究中,發(fā)現(xiàn)種子的β-淀粉酶基因轉(zhuǎn)錄水平和β-淀粉酶活性受到SNP的促進(jìn)[12],這暗示在種子萌發(fā)過(guò)程中,種子內(nèi)含物質(zhì)的變化會(huì)受到NO的影響。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)0.10 mmol/L SNP浸種,雖可對(duì)種子蛋白質(zhì)和粗脂肪含量的下降有一定的促進(jìn)作用,但效果不顯著;而0.10 mmol/LSNP浸種可顯著降低淀粉和增加可溶性糖含量。用抑制種子萌發(fā)的NO生物合成抑制劑1.00 mmol/L L-NAME浸種,同樣發(fā)現(xiàn),它們對(duì)淀粉降解的抑制作用非常明顯,12 h后便觀察到可溶性糖含量的顯著下降,而1.00 mmol/L L-NAME對(duì)種子蛋白質(zhì)和粗脂肪含量的影響不大。這些結(jié)果與孫永剛等[12]的結(jié)果相符。

    種子萌發(fā)過(guò)程中內(nèi)含物質(zhì)的變化一般與種子內(nèi)水解酶活性的變化相對(duì)應(yīng)。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)0.10 mmol/L SNP處理可顯著增加α-淀粉酶、硝酸還原酶和脂肪水解酶活性;β-淀粉酶活性雖在處理36 h時(shí)后呈逐漸下降趨勢(shì),但前期(12~36 h)也明顯受SNP促進(jìn)。而用1.00 mmol/L L-NAME浸種,種子的α-淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪水解酶和硝酸還原酶活性均受到抑制。這些結(jié)果暗示,NO可能通過(guò)調(diào)節(jié)α-淀粉酶、β-淀粉酶、硝酸還原酶和脂肪酶等水解酶的活性,影響種子體內(nèi)貯藏物質(zhì)的降解,進(jìn)而影響萵苣種子萌發(fā),其中,對(duì)淀粉降解和可溶性糖增加的促進(jìn)作用最為明顯。

    [1]張愛(ài)慧,朱士農(nóng).外源一氧化氮對(duì)不同貯藏年限甘藍(lán)、黃瓜種子萌發(fā)活力的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(3):109-111.

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