氟化物對家蠶血液羧酸酯酶及全酯酶活性的影響

米 智，阮成龍，李姣蓉，付巧娟，杜文華，李冠楠，隆耀航，朱 勇

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400716)

近年來隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，陶瓷、磚瓦、磷肥、煉鋁、水泥、玻璃、火力發(fā)電和金屬冶煉等部門排放以氟化物為主的大氣污染給蠶桑生產(chǎn)帶來的危害越來越大。氟化物是一類原生質(zhì)毒劑，研究表明，氟化物隨桑葉進(jìn)入蠶體累積于消化液、腸壁和體壁等處，通過消化管進(jìn)入血液，在血液和組織中與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制生長發(fā)育，出現(xiàn)氟中毒癥狀［1］。氟中毒能損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，內(nèi)分泌系統(tǒng)及心、肝、腎等，并引起生物酶學(xué)改變和免疫功能改變［2］。

酯酶是昆蟲體內(nèi)一種重要的代謝酶，屬于水解酶，具有廣泛的底物專一性。一方面殺蟲劑對酯酶活性有抑制作用，另一方面酯酶可對某些殺蟲劑進(jìn)行代謝［3-4］。羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE，EC3.1.1)是一種解毒水解酶。能夠與進(jìn)入昆蟲體內(nèi)的有機(jī)磷殺蟲劑快速結(jié)合，將殺蟲劑在到達(dá)靶標(biāo)作用位點(diǎn)之前阻隔或降解，降低殺蟲劑對昆蟲的毒害，使昆蟲產(chǎn)生抗性［5-6］。CarE能夠催化酯類和酰胺類化合物水解，在神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞過程中起重要作用［7］。在抗性昆蟲中，CarE活性的提高主要是由基因擴(kuò)增使得表達(dá)量的增加(量變)或催化效率提高(質(zhì)變)所引起的［8-11］。傳統(tǒng)方法主要通過單個(gè)基因的克隆、表達(dá)和突變分析等，來研究基因在抗性形成中的作用［12-15］。

本試驗(yàn)通過研究家蠶添食NaF后血液中全酯酶和CarE的活性變化，為從生理生化水平上闡明家蠶對氟化物的代謝機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

家蠶耐氟品種T6、敏感品種734，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供，西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院家蠶遺傳育種室保存。按照常規(guī)方法飼養(yǎng)到5齡起蠶時(shí)，對照組喂食清水浸泡11 min后自然晾干的新鮮桑葉，試驗(yàn)組分別用50、100、200、400 mg/kg NaF溶液浸泡11 min后自然晾干的桑葉飼養(yǎng)［16］，每隔8 h添食1次，每天添食3次。試驗(yàn)采用平行設(shè)計(jì)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。從5齡起蠶第1—7天每天分別取各組幼蟲的血液樣品。

1.2 家蠶血液酶液的制備

將蠶體表用蒸餾水擦洗處理后，并用吸水紙擦干，使蠶體彎曲，用無菌剪刀剪其腹足讓血液滴入放有少許苯基硫脲的預(yù)冷離心管中，在0—4℃，5000r/min離心15min，取上清液用0.04mol/L pH7.0的PBS稀釋50倍作為酶液，放置于-70℃冰箱內(nèi)備用。

1.3 測定方法

1.3.1 羧酸酯酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取 7 個(gè)干燥潔凈的試管依次分別加入 1×10-4mol/L α-萘酚 0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，對應(yīng)加0.04mol/L pH7.0 磷酸緩沖液 6.0、5.8、5.6、5.2、4.8、4.4、4.0mL，然后分別加入顯色劑(1% 固藍(lán) B 鹽(需避光保存)和5%SDS按2∶5混合，現(xiàn)配現(xiàn)用)1mL，搖勻后30℃水浴保溫30 min，在600 nm處測定OD值，重復(fù)3次，以O(shè)D600的平均值為縱坐標(biāo)，α-萘酚的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得方程為:y=30.99x-0.008，R2=0.999。

1.3.2 家蠶血液羧酸酯酶活性測定

參照Van Aspern［17］的方法適當(dāng)修改后進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。2500μL 3×10-4mol/L的α-醋酸萘酯溶液(含1×10-4mol/L毒扁豆堿)和500 μL工作酶液(20 μL酶液和480 μL 0.04mol/L pH 7.0 PBS)混合，在30℃水浴中反應(yīng)30min后，加入500 μL顯色劑后，搖勻，靜置15min，待溶液變成穩(wěn)定的藍(lán)色后，用分光光度計(jì)在600nm處測OD值。根據(jù)30min內(nèi)生成的α-醋酸萘酚的毫摩爾數(shù)表示酶的活性(μmol/mL α-萘酚)。

1.3.3 家蠶血液全酯酶活性測定

同羧酸酯酶測定方法［17］基本一樣，只是在α-醋酸萘酯溶液中不加毒扁豆堿溶液。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel軟件對CarE和全酯酶活性做柱狀圖分析;運(yùn)用SPSS17.0軟件對CarE和全酯酶的活性采用Duncan方法進(jìn)行多重比較，比較的顯著水平為P=0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟化物對家蠶血液CarE活性的影響

2.1.1 相同暴露濃度下的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系

整體上來看，734、T6各濃度NaF處理組的前3d CarE活性都很平穩(wěn)，734的400mg/kg NaF處理組在第2天酶活性上升的幅度較大，其余各濃度處理組在第2天稍有上升;T6的100mg/kg NaF處理組在第2天呈上升趨勢，其余各濃度處理組在第2天略呈下降趨勢。在后4d內(nèi)734各濃度NaF處理組的CarE活性變化范圍較大，第4天的酶活性均高于前3d的，且對照組、100、400mg/kg NaF處理組均出現(xiàn)了峰值;第5天的50mg/kg NaF處理組的酶活性仍上升，200mg/kg NaF處理組的酶活性略呈下降趨勢，其余各組下降幅度較大;最后2d內(nèi)，對照組、200、400mg/kg NaF處理組呈上升趨勢，50mg/kg NaF處理組在第6天下降，第7天上升，100mg/kg NaF處理組呈平緩的下降趨勢。T6各處理組的CarE活性與734相比較平穩(wěn)，對照組在第6天的CarE活性最高，達(dá)12μmol/mL，其余時(shí)間段均小于8μmol/mL;50mg/kg NaF處理組在4-6d內(nèi)呈下降趨勢，第7天活性又上升;100mg/kg NaF處理組在第4天活性最高，最后3d活性很平穩(wěn)，約3μmol/mL;200mg/kg NaF處理組在4—5d的酶活性較平穩(wěn)，在6—7d時(shí)酶活性上升，且達(dá)最大值;400mg/kg NaF處理組在4—7d內(nèi)CarE活性一直很平穩(wěn)，在2—5μmol/mL之間波動。

2.1.2 同一暴露時(shí)間內(nèi)的濃度效應(yīng)關(guān)系

添氟處理1d后，734隨著添氟濃度的增加，CarE活性呈先降后升再降的變化趨勢，而T6呈先降后升的趨勢;添氟處理2d后，734CarE活性隨著添氟濃度的增加呈先降后升的趨勢，T6的100mg/kg NaF處理組的活性稍高于其他處理組，其余各組的活性均很相近;添氟處理3d后，734的400mg/kg NaF處理組的CarE活性顯著低于其他處理組，其余各組的活性很平穩(wěn)，T6的50mg/kg NaF處理組低于其他各處理組;添氟處理4d后，734各處理組的變化范圍較大，呈“W”型，T6的2個(gè)高濃度添氟組的酶活性低于其余3個(gè)處理組;添氟處理5d后，734各處理組的變化仍很大，呈“M”型，且50mg/kg NaF處理組的酶活性最高，T6添氟組的酶活性低于對照組，100mg/kg NaF處理組的酶活性最低;添氟處理6d后，734呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢，且400mg/kg NaF處理組的酶活性最低，T6添氟組的酶活性顯著低于對照組;添氟處理7d后，734和T6添氟組的變化趨勢基本一致，734對照組的酶活性最高，而T6對照組的酶活性最低。

圖1 734的5齡幼蟲添食NaF后血液CarE活性的變化Fig.1 Variations of CarE activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori 734 after treatment with NaF

2.2 添食氟化物對家蠶血液全酯酶活性的影響

2.2.1 相同暴露濃度下的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系

對照組中，734全酯酶活性前2d呈下降趨勢，后5d里酶活性變化很平穩(wěn)略高于前2d，T6隨添氟時(shí)間的增加酶活性呈上升趨勢，且在第4、7天分別出現(xiàn)峰值;50mg/kg NaF處理組，734前4d呈先降后升的趨勢，后3d酶活性呈平緩的下降趨勢，T6整體上呈上升趨勢，在第2、4、7天出現(xiàn)峰值;100 mg/kg NaF處理組，734前3d呈平緩的下降趨勢，后4d呈波浪式變化，T6前3d全酯酶活性較相似，第4天出現(xiàn)一個(gè)上升的峰值，后3d呈上升的趨勢;200 mg/kg NaF處理組，734在試驗(yàn)期酶活性基本相似，僅在第1、4天略高于其它時(shí)間點(diǎn)，T6前3d酶活性很平穩(wěn)，第4天酶活性稍升高，后3d酶活性呈上升趨勢;400 mg/kg NaF處理組，734第6天全酯酶活性顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)，其余6d的酶活性在62—64μmol/mL之間波動，T6的全酯酶整體上呈平穩(wěn)的上升趨勢。

圖2 T6的5齡幼蟲添食NaF后血液CarE活性的變化Fig.2 Variations of CarE activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori T6 after treatment with NaF

2.2.2 同一暴露時(shí)間內(nèi)的濃度效應(yīng)關(guān)系

添氟處理1d后，734的50mg/kg NaF處理組的酶活性最低，之后隨著添氟濃度增加，酶活性升高，但400 mg/kg NaF處理組的酶活性低于200 mg/kg NaF處理組，T6各濃度之間的酶活性幾乎為一直線，50 mg/kg NaF處理組略低于其它處理組，100 mg/kg NaF處理組略高于其他組;添氟處理2d后，734對照組和50 mg/kg NaF處理組的全酯酶活性呈下降趨勢，之后隨著濃度的增加酶活性增加，T6各濃度的酶活性約為一直線，50 mg/kg NaF處理組酶活性略高于其它組，200 mg/kg NaF處理組略低于其它組;添氟處理3d后，734全酯酶的變化趨勢同處理2d后相似，T6各處理組酶活性幾乎仍是一直線，呈稍稍下降趨勢;添氟處理4d后，734對照組和兩個(gè)低濃度組呈下降趨勢，200 mg/kg NaF處理組略上升，而400 mg/kg NaF處理組又下降，T6對照組和兩個(gè)低濃度的酶活性相當(dāng)，但遠(yuǎn)大于兩個(gè)高濃度處理組的活性;添氟處理5d后，734的酶活性變化同處理4d后，T6隨著濃度的增加呈下降趨勢;添氟處理6d后，734對照組和兩個(gè)低濃度處理組的酶活性變化較平穩(wěn)，而兩個(gè)高濃度組的酶活性呈驟降趨勢，T6全酯酶活性同添氟處理5d后的變化趨勢;添氟處理7d后，734全酯酶活性變化較平穩(wěn)，幾乎呈一直線，而T6對照組的酶活性最高，50、100和200mg/kg NaF處理組酶活性很平穩(wěn)，400mg/kg NaF處理組酶活性驟降。

圖3 734的5齡幼蟲添食NaF后血液全酯酶活性的變化Fig.3 Variations of esterase activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori 734 after treatment with NaF

2.3 不同濃度氟化物及氟化物處理后不同天數(shù)的CarE活性差異分析

734的兩個(gè)低濃度添氟組不僅和對照組而且與兩個(gè)高濃度添氟組之間的差異均極顯著，但對照組與高濃度添氟組之間的差異不顯著;而T6各處理組之間的差異均不顯著。2品種間在各個(gè)添氟濃度下的差異極顯著(表1)。

734的CarE活性在添氟后4、6、7d與其他時(shí)間點(diǎn)差異極顯著，而且第7天與前6d的酶活性差異也極顯著，T6在添氟處理后7d內(nèi)的CarE活性差異均不顯著。2品種添氟后1d和3d差異不顯著，其余各時(shí)間點(diǎn)差異極顯著(表2)。

圖4 T6的5齡幼蟲添食NaF后血液全酯酶活性的變化Fig.4 Variations of esterase activity of hemolymph in 5th instar larvae of Bombyx mori T6 after treatment with NaF

表1 734與T6添食不同濃度氟化物后CarE和全酯酶活性多重比較Table 1 Multiple comparison on activity variations of CarE and esterase between 734 and T6 after treatment with different sodium fluoride

表2 734與T6添食NaF后不同時(shí)間段CarE和全酯酶活性多重比較Tabel 2 Multiple comparison on activity variations of CarE and esterase at different time between 734 and T6 after treatment with sodium fluoride

2.4 不同濃度氟化物及氟化物處理后不同天數(shù)的全酯酶活性差異分析

734各處理組之間的差異均不顯著，T6對照組與高濃度添氟組差異極顯著，2品種在同一添氟濃度間的差異極顯著(表1)。

734在添氟后第2天與第4、5、7天差異極顯著，T6添氟分為1—3d、4—6d和7d三組，三組之間的差異極顯著，組內(nèi)差異不顯著。2品種在添氟處理后的各個(gè)時(shí)間段差異極顯著(表2)。

3 討論

CarE是多功能家族酶，普遍存在于動物、植物、昆蟲和微生物中，并在異生物質(zhì)(藥物、殺蟲劑、致癌物等)的解毒、信息素的降解、神經(jīng)的發(fā)生和調(diào)控中扮演著重要角色［18］。CarE水解包含羧酸酯、酰胺和硫酯等官能團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)，在藥物代謝和殺蟲劑解毒方面發(fā)揮著重要的作用［19］。二斑葉螨(Tetranychus urticae)對殺螨劑的抗性通常與體內(nèi)解毒酶［20-22］(酯酶、多功能氧化酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)的變化有關(guān)，也涉及靶標(biāo)不敏感機(jī)制［23］。Van Leeuwen等［24］測定了田間多抗二斑葉螨酯酶活性，發(fā)現(xiàn)抗性種群中的酶活性較敏感品系為高。Achaleke等［25］發(fā)現(xiàn)抗擬除蟲菊酯的棉鈴蟲酯酶活性高于敏感品系。很多學(xué)者用不同昆蟲實(shí)驗(yàn)同樣得出了CarE活力與擬除蟲菊酯和有機(jī)磷的抗性成正相關(guān)，分子生物學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，酯酶活性的升高是由于酯酶結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增［26］。而本實(shí)驗(yàn)對家蠶進(jìn)行添食NaF，檢測其血液中的CarE活性，得到了與其相反的結(jié)論，原因可能是氟化物和常用的有機(jī)殺蟲劑在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有本質(zhì)區(qū)別，殺蟲劑進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后，抑制了靶酶正常的生理功能，或作用于神經(jīng)軸突阻斷了神經(jīng)傳導(dǎo)或產(chǎn)生毒素而導(dǎo)致昆蟲死亡，而氟化物可能是酶的抑制劑，替換了酶活性位點(diǎn)中的某些離子，使酶活性下降。也可能與CarE表達(dá)和活性存在物種和組織特異性有關(guān)［27］。734在1—3d時(shí)，各處理組(400 mg/kg NaF處理組除外)的CarE活性變化平穩(wěn)，且添氟組的活性低于對照組，因?yàn)樾Q體自身的免疫系統(tǒng)可以在短時(shí)間內(nèi)抵抗毒物的危害，各種與解毒相關(guān)的酶在此期間發(fā)揮其相應(yīng)的作用［28］，但在4—7d時(shí)，各個(gè)添氟處理組的CarE活性出現(xiàn)無規(guī)律大幅度的變化，尤其400 mg/kg NaF處理組，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期波動范圍最大，高濃度NaF處理則能引發(fā)蠶體短時(shí)間中毒，進(jìn)而導(dǎo)致蠶體代謝系統(tǒng)紊亂，氟可能以間接的方式，在高劑量下擾亂酶系統(tǒng)已被報(bào)道［29］。734的兩個(gè)低濃度添氟組的活性不僅和對照組而且與兩個(gè)高濃度添氟組之間的差異均極顯著(P＜0.01)。T6各處理組酶活性差異不顯著。

酯酶是昆蟲體內(nèi)一種重要的解毒酶系，它可以通過水解酯類毒性化合物的酯鍵，或與親脂類有毒化合物結(jié)合，降低其有效濃度來降低有毒化合物的毒性。因此，酯酶在昆蟲對這幾類殺蟲劑的抗性中起著重要的作用［30-31］。T6和734添食NaF后全酯酶的平均活性都表現(xiàn)出下降的趨勢，說明NaF對家蠶血液全酯酶的活性也起到抑制作用。734的50 mg/kg添氟組在1—3d的酶活性處于最低，推測可能是低濃度的NaF在短期內(nèi)對敏感品種家蠶全酯酶的抑制作用很大，而高濃度NaF使蠶體及早進(jìn)入各項(xiàng)防御應(yīng)激措施，避免受到嚴(yán)重?fù)p害。T6兩個(gè)高濃度添氟組在2—7d內(nèi)的全酯酶活性一直低于其他處理組，在6—7d最高濃度添氟組的全酯酶活性遠(yuǎn)低于其他處理組，長時(shí)間添食高濃度的氟化物，會嚴(yán)重抑制蠶體全酯酶的活性，影響蠶體正常生長發(fā)育，甚至死亡。整體上T6各處理組的全酯酶活性在4—7d的活性要高于前3d的活性，隨著時(shí)間的增加，蠶體要為進(jìn)入化蛹階段做準(zhǔn)備，故要提高各種解毒酶的活性或增加各種解毒酶的量來作用氟化物。T6與734兩品種的全酯酶在相同時(shí)間點(diǎn)活性差異均極顯著(P＜0.01)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不論是CarE還是全酯酶，734的酶活性要大于T6，可能是敏感品種在NaF作用下，蠶體需要大量的解毒酶或提高相關(guān)酶活性來代謝或作用于NaF，而耐氟品種其蠶體本身對NaF的代謝或抵抗能力很強(qiáng)，故其酶活性低于敏感品種，推測家蠶血液中的CarE和全酯酶活性與蠶體的耐氟性能有一定的相關(guān)性，但這2種酶在家蠶對氟化物代謝過程中的作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

致謝:感謝西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院朱勇教授對實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)。

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