轉(zhuǎn)mapk雙鏈RNA干擾表達(dá)載體黃瓜對(duì)根際土壤細(xì)菌多樣性的影響

陳國(guó)華 ，弭寶彬，李 瑩，李春月

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081;2.中南大學(xué)研究生院隆平分院，長(zhǎng)沙 410125;3.北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 132013;4.吉林省白山市靖宇縣第一中學(xué)，白山 134300)

土壤細(xì)菌是土壤中數(shù)量最豐富、分布最廣泛的微生物類群，它占土壤微生物總量的70%—90%。土壤細(xì)菌廣泛參與土壤有機(jī)質(zhì)積累、營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)過程，其多樣性和活性是保持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的基礎(chǔ)。土壤細(xì)菌對(duì)外界干擾比較敏感，是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警指標(biāo)，常用于研究轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的安全性。目前，很多科學(xué)家針對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)土壤微生物多樣性和生物活性的影響進(jìn)行大量研究［1-4］，以揭示Bt蛋白對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性。轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物的影響由轉(zhuǎn)基因作物釋放到土壤中的外源蛋白的化學(xué)和生物學(xué)特性引起的，或者由轉(zhuǎn)基因植株的生理生化特性改變?cè)斐傻模?］。隨著RNAi技術(shù)的發(fā)展，利用表達(dá)雙鏈RNA的RNA干擾作用來防治病蟲害的轉(zhuǎn)基因作物越來越多。相對(duì)于表達(dá)外源蛋白的轉(zhuǎn)基因作物來說，表達(dá)雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物的影響可能會(huì)通過分泌RNA對(duì)土壤微生物起作用。目前，針對(duì)表達(dá)雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)安全性的研究未見報(bào)道。

陳國(guó)華等利用RNAi技術(shù)成功地沉默了線蟲mapk基因，致使南方根結(jié)線蟲的生長(zhǎng)發(fā)育受阻而導(dǎo)致死亡，并成功的構(gòu)建了表達(dá)mapk雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因黃瓜植株，通過黃瓜表達(dá)mapk的雙鏈RNA沉默根結(jié)線蟲的mapk基因，對(duì)根結(jié)線蟲具有良好的防治效果［6］。MAPK信號(hào)途徑在生物中廣泛存在，為了明確mapk雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因黃瓜植株是否對(duì)根際土壤細(xì)菌具有影響，本研究采用細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫方法對(duì)種植轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤的細(xì)菌群落類群多樣性進(jìn)行分析，以期為轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及材料

試驗(yàn)田位于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所溫室基地。供試黃瓜品種為新泰密刺，轉(zhuǎn)基因黃瓜材料轉(zhuǎn)入MiMPK1基因片段dsRNA表達(dá)載體，非轉(zhuǎn)基因黃瓜為普通新泰密刺。試驗(yàn)田連續(xù)種植轉(zhuǎn)基因黃瓜和非轉(zhuǎn)基因黃瓜3a，種植方式為一年兩茬輪作。黃瓜正常管理施肥。

1.2 土壤取樣方法

土壤取樣時(shí)間為2012年6月14日和下半年9月14旬，為黃瓜結(jié)果期。兩次土壤樣品混合在一起。土壤取樣采用五點(diǎn)采樣法，用土壤采樣器采集10株黃瓜根系5cm范圍內(nèi)黃瓜根際土壤，采集深度為0—15 cm的土樣，混合后用密封袋帶回，土樣用2 mm孔徑篩網(wǎng)過篩，去除顆粒硬物和黃瓜根系。

1.3 土壤微生物DNA提取

采用土壤總DNA提取試劑盒(美國(guó)MOBIO公司)提取土壤微生物DNA。按照試劑盒說明書，分別提取轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤DNA，每個(gè)處理分別提取5份土壤微生物DNA，分別混合，經(jīng)電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量，-20℃保存。

1.4 16S rRNA基因克隆文庫構(gòu)建

采用通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACTTGTTACG ACTT-3')［7］從土壤微生物DNA中擴(kuò)增16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系20 μL，具體如下:1 μL DNA模板 (100ng)，0.5μmol/L引物，0.2 mmol dNTPs，5 units of EasyTaq DNA聚合酶、1×反應(yīng)緩沖液，13.7μL dd水。為了減少擴(kuò)增偏嗜性，采用梯度PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，且重復(fù)5次，將PCR產(chǎn)物混合。PCR反應(yīng)程序如下:95℃ 4 min;95℃ 30 s，52℃至58℃ 30 s，72℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。

將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，割膠純化，連接入PGM-T載體(天根生化科技有限公司)，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，在涂有IPTG和X-gal的安芐青霉素LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)200個(gè)挑取白色克隆構(gòu)成16S rRNA基因文庫，將克隆培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基(安芐青霉素50 μg/mL)中振蕩培養(yǎng)8 h，菌液PCR進(jìn)行陽性克隆鑒定，采用引物為T7和SP6。隨機(jī)挑取150個(gè)陽性克隆送諾塞基因公司測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Chimera Check程序?qū)⑺?6S rRNA基因序列在RDP(Ribosomal Database Project)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)，去除嵌合體序列。以97%為劃定閾值，用DOTUR軟件包對(duì)16S序列劃分操作分類單元(OTU)，并構(gòu)建稀缺性曲線［8］。

多樣性指數(shù)依據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算［9］:

式中，pi代表每個(gè)物種樣本數(shù)量占總樣本數(shù)量的比例。

均勻度: 式中，豐富度(S)是樣本中物種的數(shù)量，這里等同OTU的數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤細(xì)菌類群

非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤細(xì)菌16S rRNA克隆文庫測(cè)序150個(gè)克隆，以97%劃分OTU，獲得124個(gè)OTU。轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤細(xì)菌16S rRNA克隆文庫測(cè)序150個(gè)克隆，獲得122個(gè)OTU。兩個(gè)文庫共同包含的克隆共有115個(gè)，這表明兩個(gè)文庫細(xì)菌類群比較一致。

轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤細(xì)菌分為 13個(gè)類群(圖 1A):Acidobacteria、Actinobacteria、Armatimonadetes、Bacteroidetes、candidate division BRC1、Chloroflexi、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Nitrospira、Planctomycetes、Proteobacteria、Verrucomicrobia、unclassified_Bacteria。Proteobacteria 為 優(yōu) 勢(shì) 種 群，占 24.1%;其 次 為Bacteroidetes，占19.0%，再次為Chloroflexi，占16.8%;Acidobacteria占11.7%，其他種群比例相對(duì)較低。這表明轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群為Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Acidobacteria，而其他細(xì)菌類群為非優(yōu)勢(shì)菌群。

非轉(zhuǎn)基因黃瓜根際土壤細(xì)菌分為14個(gè)類群(圖1B):Acidobacteria、Actinobacteria、Armatimonadetes、Bacteroidetes、 BRC1、 Chloroflexi、 Cyanobacteria/Chloroplast、 Firmicutes、 Gemmatimonadetes、 Nitrospira、Planctomycetes、Proteobacteria、Verrucomicrobia、unclassified_Bacteria。其中 Proteobacteria 是優(yōu)勢(shì)菌群，占22.8%;其次為Bacteroidetes，占19.9%;Chloroflexi占17.6%，Acidobacteria占10.3%，其他類群數(shù)量相對(duì)較少。這表明在非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群為Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Acidobacteria，而其他細(xì)菌類群為非優(yōu)勢(shì)菌群。

2.2 轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤細(xì)菌多樣性比較

轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤細(xì)菌類群差別不大，13個(gè)類群細(xì)菌為兩種土壤所共有，轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤缺少Cyanobacteria/Chloroplast細(xì)菌類群，而該類群細(xì)菌在非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤比例很低，僅僅為0.7%。在優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群上，轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤基本一致，Proteobacteria、Bacteroidetes、Chloroflexi和Acidobacteria均為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群，但在比例上存在細(xì)微差別。轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤中，Proteobacteria和Acidobacteria的比例略高于非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤，而Bacteroidetes和Chloroflexi的比例略低于非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤?？傮w來看，兩種土壤細(xì)菌類群無顯著差異。

圖1 文庫各門細(xì)菌比例Fig.1 Proportions of bacteria in two libraries at phylum

圖2 轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤細(xì)菌類群比較Fig.2 Comparison of bacteria groups between transgenic cucumber soil and non-transgenic cucumber soil

在綱分類水平上，兩種土壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群差異也不大(圖3)。在Acidobacteria門細(xì)菌中，兩種土壤包含6 個(gè)綱的細(xì)菌，Acidobacteria_Gp3、Acidobacteria_Gp4、Acidobacteria_Gp5、Acidobacteria_Gp6、Acidobacteria_Gp25和 unclassified Acidobacteria，其中 Acidobacteria_Gp6為優(yōu)勢(shì)菌群。在 Bacteroidetes門中，包含Bacteroidetes_incertae_sedis、Flavobacteria、Sphingobacteria 和unclassified Bacteroidetes，其中Sphingobacteria 綱細(xì)菌數(shù)量最多。在Chloroflexi門細(xì)菌中，兩種土壤的unclassified Chloroflexi細(xì)菌最多，這表明土壤中存在大量的細(xì)菌新類群。在Proteobacteria門細(xì)菌類群中，兩種土壤細(xì)菌分屬于Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria和Gammaproteobacteria，其中Betaproteobacteria綱的細(xì)菌數(shù)量最多，Deltaproteobacteria細(xì)菌數(shù)最少。

圖3 綱分類水平上兩種土壤優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群比較Fig.3 Comparison of the dominant bacteria groups in two libraries at class level

從多樣性指數(shù)來看(表1)，轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤的細(xì)菌群落差異不大。Shannon評(píng)價(jià)一個(gè)群落物種多樣性，其值越高，表明群落的物種多樣性越高。兩種土壤的Shannon指數(shù)均為4.6，這表明兩種土壤細(xì)菌多樣性無顯著差別。Simpson也是描述群落物種多樣性的指數(shù)，兩種土壤細(xì)菌的Simpson指數(shù)差異不大，也反映出兩種土壤細(xì)菌的多樣性差異不大。Chao是描述群落豐富度的指數(shù)，其值越高表明群落物種的豐富度越高。非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤細(xì)菌群落的Chao高于轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤，這表明非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤細(xì)菌的豐度略高于轉(zhuǎn)基因土壤。

表1 轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 1 The index of diversity of two libraries

3 討論

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，利用RNAi技術(shù)培育抗病新品種更是有效的植物病害防治方法。Yadav等將編碼根結(jié)線蟲特異聯(lián)接因子和整合酶的管家基因的雙鏈RNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草，表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)根結(jié)線蟲具有很高抗性，證實(shí)利用RNAi方法控制植物寄生害蟲是一個(gè)十分有效的策略［10］。本研究采用的轉(zhuǎn)基因黃瓜材料能夠表達(dá)mapk的雙鏈RNA，能夠靶向的抑制根結(jié)線蟲mapk基因的表達(dá)，有效控制根結(jié)線蟲的侵染，具有廣闊的應(yīng)用前景［6］。然而，針對(duì)該轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)安全性還未進(jìn)行研究。

土壤細(xì)菌作為土壤中最豐富的微生物，其種群多樣性和功能多樣性對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定具有重要意義。因此，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的安全性必須考慮轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物對(duì)土壤細(xì)菌的影響。目前，針對(duì)轉(zhuǎn)Bt和抗除草劑基因的轉(zhuǎn)基因作物安全性進(jìn)行了大量研究［11-12］，有些研究表明轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生了顯著影響［13］，有些研究得出相反的結(jié)論［14］。轉(zhuǎn)Bt植物在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的Bt蛋白會(huì)以根系分泌物的形式進(jìn)人到土壤中，并牢牢結(jié)合在土壤顆粒中難以降解，最終對(duì)土壤微生物造成影響。迄今為止，針對(duì)雙鏈RNA在土壤中的殘留動(dòng)態(tài)情況和雙鏈RNA轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)安全性研究未見報(bào)道。

從本研究結(jié)果來看，轉(zhuǎn)mapk雙鏈RNA黃瓜并未對(duì)根際土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生明顯的影響。造成這種情況，可能基于4個(gè)方面的原因:(1)外源的雙鏈RNA表達(dá)特異性，它們只能在植物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)［15］。未有研究表明雙鏈RNA能夠分泌到植物體表。(2)雙鏈RNA發(fā)揮作用需要依賴真核生物的Dicer酶［16］，而細(xì)菌不具有Dicer酶，雙鏈RNA無法對(duì)細(xì)菌起作用。(3)雙鏈RNA只針對(duì)同源性較高的靶基因起RNA干擾作用［16］，細(xì)菌不具有與mapk同源的基因。(4)土壤環(huán)境樣品中RNA酶含量豐富，RNA易被降解［17］。即使分泌到植物體外的雙鏈RNA也會(huì)很快被土壤RNA酶降解。由于轉(zhuǎn)基因黃瓜的mapk雙鏈RNA特性和土壤環(huán)境的影響，使得轉(zhuǎn)基因黃瓜對(duì)根際土壤細(xì)菌群落的影響較小，而溫室的特殊環(huán)境對(duì)土壤細(xì)菌的影響可能更大。

本研究中土壤取自黃瓜連作溫室，溫室環(huán)境特殊，如高溫高濕、高有機(jī)質(zhì)含量、高復(fù)種指數(shù)，這會(huì)對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生一定的影響。黃瓜連作田土壤微生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生顯著改變，導(dǎo)致微生物種群平衡遭受破壞，根際微生態(tài)平衡的失調(diào)［18］，且黃瓜根際細(xì)菌種類和數(shù)量變化與黃瓜根分泌物密切相關(guān)［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤和非轉(zhuǎn)基因黃瓜土壤中Proteobacteria為優(yōu)勢(shì)菌群。這與他人的研究結(jié)果基本一致［20-22］。另外，在本研究?jī)煞N土壤中，Bacteroidetes和Acidobacteria的比例也相對(duì)較高，也與他人研究結(jié)果基本符合［20-22］。此外，Chloroflexi的比例也較高。Janssen通過16S rRNA基因克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)Chloroflexi在土壤中數(shù)量豐富，由于該類細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，很難用培養(yǎng)法分離獲得［23-24］。Chloroflexi是海綿中大量存在，與海綿形成共生體，對(duì)于海綿來說具有重要的生態(tài)功能［25］。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，該類細(xì)菌的生態(tài)功能還有待深入研究。

總體來看，雙鏈RNA轉(zhuǎn)基因黃瓜并未對(duì)土壤細(xì)菌群落產(chǎn)生明顯影響，但后續(xù)的長(zhǎng)期觀察以及對(duì)根際土壤真核生物群落的影響還需深入研究。

［1］Stotzky G.Persistence and biological activity in soil of insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis and of bacterial DNA bound on clays and humic acids.Journal of Environmental Quality，2000，29(3):691-705.

［2］Philip J.Dale B C，Eliana M G F.Potential for the environmental impact of transgenic crops.Nature Biotechnology，2002，20:567-574.

［3］Devare M H，Jones C M，Thies J E.Effect of Cry3Bb Transgenic Corn and Tefluthrin on the Soil Microbial Community.Journal of Environmental Quality，2004，33(3):837-843.

［4］Susanne B，Christoph C T.Field studies on the environmental fate of the Cry1Ab Bt-toxin produced by transgenic maize(MON810)and its effect on bacterial communities in the maize rhizosphere.Molecular Ecology，2005，14(8):2539-2551.

［5］Yang Y H.Advances on the effects of genetically modified crops on soil microbial community and main countermeasures of their approaches.Journal of Agricultural Biotechnology，2011，19(1):1-8.

［6］Chen G H，Xiao L，Zhang S Q，Xie B Y.Analysis of silencing MAPK by RNA interference of root-knot nematode:Acta Phytopathologica Sinica，2008，38(5):509-513.

［7］Lane，D.J.16S/23S rRNA sequencing.In:Nucleic acid techniques in bacterial systematics.Stackebrandt，E.，and Goodfellow，M.，eds.，John Wiley and Sons，New York，NY，1991，pp.115-175.

［8］Schloss P D，Handelsman J.Introducing DOTUR，a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness.Applied and Environmental Microbiology，2005，71(3):1501-1506.

［9］Rani A，Porwal S，Sharma R，Kapley A，Purohit HJ，Kalia V C.Assessing microbial diversity by culture-dependent and independent approaches for efficient functioning of effluent treatment plants.Bioresource Technology，2008，99:7098-7107.

［10］Yadav BC，Veluthambi K，Subramaniam K.Host-generated double stranded RNA induces RNAi in plant-parasitic nematodes and protects the host from infection.Molecular＆ Biochemical Parasitology，2006，148:219-222.

［11］Lu X M，Zhu L Q，Cao Y P.Recent Advances of Bt Crops and Its Safety Assessment.Journal of Shanghai Jiaotong University(Agricultural Science)，2006，24(2):214-220.

［12］Means N E，Kremer R J，Ramsier C.Effects of glyphosate and foliar amendments on activity of microorganisms in the soybean rhizosphere.Journal of Environmental Science and Health，Part B:Pesticides，F(xiàn)ood Contaminants，and Agricultural Wastes，2007，42(2):125-132.

［13］Baumgarte S，Tebbe C C.Field studies on the environmental fate of the Cryl Ab Bt-toxin produced by transgenic maize(MON8 10)and its effect on bacterial communities in the maize rhizosphere.Molecular Ecology，2005，14(8):2539-2551.

［14］Shen R F，Cai H，Gong W H.Transgenic Bt cotton has no apparent effect on enzymatic activities or functional diversity of microbial communities inrhizosphere soil.Plant and Soil，2006，285(1/2):149-159.

［15］Urwin P E，Catherine J L，Howard J A.Ingestion of Double-Stranded RNA by Preparasitic Juvenile Cyst Nematodes Leads to RNA Interference.Molecular Plant-Microbe Interactions，2002，15(8):747-752.

［16］Phillip D Z，Thomas T，Phillip A S，David P B.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell，2000，101:25-33.

［17］Tom A M，R.Elizabeth S，Penny R H.The detection of Gram-negative bacterial mRNA from soil by RT-PCR.FEMS Microbiology Letters，1998，164(2):369-373.

［18］Hu Y S，Liy Y F，Wu K，Dou H J，Jia X C.Variation of Microbial Community Structure in Relation to Successive Cucumber Cropping Soil.Chinese Journal of Soil Science，2006，37(1):126-129.

［19］Hu Y S，Wu K，Li C X，Jia XC.Effect of Continuous Cropping of Cucumber on Soil Microbial Population Ⅱ — Variation Analysis Based on DGGE Approach.Scientia Agricultura Sinica，2007，40(10):2267-2273.

［20］Liu W Q，Mao Z C，Yang Y H，Xie B Y.Microbial Community Structure in Greenhouse Field Soil Infested with Root-Knot Nematodes.Chinese Journal of Biological Control，2008，24(4):318-324.

［21］Liu W Q，Mao Z C，Yang Y H，Xie B Y.Analysis of soil bacterial diversity by Using the 16S rRNA gene Library.Acta Microbiologica Sinica，2008，48(10):1344-1350.

［22］Schloss PD，Handelsman J.Status of the microbial census.Microbiology and molecular biology Review，2004，68(4):686-691.

［23］Janssen P H.Identifying the dominant soil bacterial taxa in libraries of 16S rRNA and 16S rRNA genes.Applied and Environmental Microbiology，2006，72:1719-1728.

［24］Kathryn E R，Davis，P S，Peter H J.Acidobacteria，Rubrobacteridae and Chloroflexi are abundant among very slow-growing and mini-colonyforming soil bacteria.Environmental Microbiology，2011，13(3)，798-805.

［25］Susanne S，Peter D，F(xiàn)aris B，Michael W，Michael W T.Chloroflexi bacteria are more diverse，abundant，and similar in high than in low microbial abundance sponges.FEMS Microbiol Ecol，2011，78:497-510.

參考文獻(xiàn):

［5］楊永華.轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物群落的影響及主要研究策略.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，l9(l):1-8.

［6］陳國(guó)華，肖羅，張雙慶，等.南方根結(jié)線蟲促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因的RNAi效應(yīng)分析.植物病理學(xué)報(bào)，2008，38(5):509-513.

［11］陸小毛，朱路青，曹越平.轉(zhuǎn)Bl基因作物及其安全性研究.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版)，2006，24(2):214-220.

［18］胡元森，劉亞峰，吳坤，竇會(huì)娟，賈新成.黃瓜連作土壤微生物區(qū)系變化研究.土壤通報(bào)，2006，37(1):126-129.

［19］胡元森，吳坤，李翠香，賈新成.黃瓜連作對(duì)土壤微生物區(qū)系影響 Ⅱ——基于DGGE方法對(duì)微生物種群的變化分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40(10):2267-2273.

［20］劉瑋琦，茹振川，楊宇紅，謝丙炎.保護(hù)地根結(jié)線蟲發(fā)生地土壤微生物群落多樣性的研究.中國(guó)生物防治，2008，24(4):318-324.

［21］劉瑋琦，茆振川，楊宇紅，謝丙炎.應(yīng)用16S rRNA基因文庫技術(shù)分析土壤細(xì)菌群落的多樣性.微生物學(xué)報(bào)，2008，48(10):1344-1350.