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    左旋多巴合成研究進(jìn)展

    2013-08-02 08:16:58馬強(qiáng)強(qiáng)趙廣榮
    化工進(jìn)展 2013年6期
    關(guān)鍵詞:鄰苯二酚生物酶丙酮酸

    馬強(qiáng)強(qiáng),趙廣榮

    (天津大學(xué)化工學(xué)院系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300072)

    左旋多巴(L-DOPA)化學(xué)名為β-3,4-二羥苯 基-α-丙氨酸(3,4-2dihydroxylphenylalanine)[圖1(a)],又名3-羥基-L-酪氨酸,為白色結(jié)晶性粉,無(wú)臭無(wú)味,不溶于乙醇、氯仿和丙酮,易溶于稀酸。左旋多巴為前體藥物,其作用機(jī)理為左旋多巴能通過(guò)血腦屏障,到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng),在脫羧酶的作用下,轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶穂圖2(b)],進(jìn)而發(fā)揮治療帕金森綜合癥的作用[1]。左旋多巴于1970年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為治療帕金森綜合癥的藥物[2],在2007年世界暢銷(xiāo)藥中排名第100名,2008年銷(xiāo)售金額突破9000萬(wàn)美元。左旋多巴具有廣闊的市場(chǎng)前景[3]。

    圖1 左旋多巴和多巴胺分子結(jié)構(gòu)

    目前左旋多巴的制備方法主要有化學(xué)合成、植物提取、生物酶催化以及微生物發(fā)酵。由于化學(xué)合成和植物提取方法具有一定的局限性。20 世紀(jì)60年代末,國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者開(kāi)始探索生物酶法合成左旋多巴。日本學(xué)者Yamada 等[4]通過(guò)菌種選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化合成左旋多巴,其研究成果已用于工業(yè)化生產(chǎn)。彭珍榮等[5]在國(guó)內(nèi)開(kāi)展微生物法合成左旋多巴方面的研究。左旋多巴的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到了250 t/a,微生物酶法合成左旋多巴的生產(chǎn)效率已達(dá)到11.1 g/(L·h)[6]。本文重點(diǎn)針對(duì)生物酶催化和微生物發(fā)酵生產(chǎn)左旋多巴的研究進(jìn)行評(píng)述,并對(duì)左旋多巴合成的研究方向進(jìn)行了展望。

    1 化學(xué)合成左旋多巴

    1911年Funk C 首次利用3,4-碳酰二氧苯甲醛為原料合成左旋多巴[7]。左旋多巴中含有一個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子,因此在合成的過(guò)程中有必要保持其較高的旋光值。Knowles[8]發(fā)現(xiàn)雙膦配體 DiPAMP(phospHine ligand DiPAMP)的催化氫化,可以取得較高的對(duì)映選擇性,而且DiPAMP 第一次在脫氫氨基酸的不對(duì)稱(chēng)氫化取得了大于95%ee的高對(duì)映選擇性,隨后該思路應(yīng)用于左旋多巴的不對(duì)稱(chēng)合成,并且得到了97.5%ee 的左旋多巴。王偉文等[9]成功以愈創(chuàng)木酚為原料,經(jīng)過(guò)八步合成反應(yīng)得到多巴,且具有較高的純度與收率(圖2)。

    目前,工業(yè)化生產(chǎn)左旋多巴多以香草醛和乙內(nèi)酰脲為原料,經(jīng)過(guò)8 步的反應(yīng)制得。盡管目前商品化左旋多巴主要通過(guò)不對(duì)稱(chēng)法合成,但化學(xué)合成過(guò)程中需要大量的金屬催化物,并且過(guò)程繁雜,產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化效率和旋光活性均較低,同時(shí)具有成本高、環(huán)境污染嚴(yán)重等問(wèn)題[10]。所以開(kāi)發(fā)新的合成方法和思路是今后研究的重點(diǎn)和方向。

    2 天然植物中提取左旋多巴

    天然植物中存在左旋多巴。1913年生物化學(xué)家Guggenheim 從蠶豆中提取得到左旋多巴。之后在很多植物中均發(fā)現(xiàn)存在左旋多巴,如貓豆、藜豆 等[11],其中貓豆中的左旋多巴含量最高達(dá)到6%~9%,是提取左旋多巴最主要的原料。通過(guò)改良提取技術(shù),使得貓豆中左旋多巴的提取得率,從1.5%已提高到3.4%,純度達(dá)到99.9%[12]。雖然從植物中直接提取左旋多巴是目前的一種方法,但是由于受到原料來(lái)源的限制,并且提取步驟繁雜,產(chǎn)量小,遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。

    3 生物酶轉(zhuǎn)化合成左旋多巴

    生物酶轉(zhuǎn)化法主要以L-酪氨酸或酚類(lèi)物質(zhì)為底物,通過(guò)來(lái)源于微生物的酶體外制取左旋多巴。目前已報(bào)道3 種酶可以催化多巴的生成:①酪氨酸酚解酶,該酶以鄰苯二酚、氨水以及丙酮酸為底物;②酪氨酸酶,該酶以酪氨酸為底物,羥化酪氨酸生成左旋多巴;③轉(zhuǎn)氨酶,該酶將來(lái)源于天冬氨酸或谷氨酸上的氨基轉(zhuǎn)移至3,4-二羥基苯丙酮酸,生成左旋多巴。

    3.1 酪氨酸酚解酶法合成

    酪氨酸酚解酶(tyrosine phenol lyase,TPL)(EC 4.1.99.2)可催化苯酚、丙酮酸和氨水生成酪氨酸,該反應(yīng)為可逆反應(yīng)。若將苯酚置換成鄰苯二酚,該酶即可催化生成左旋多巴(圖3),催化反應(yīng)過(guò)程中需要磷酸吡哆醛(胺)為輔酶、鉀離子和氨離子為輔因子[13]。該酶廣泛存在于多種微生物中,如假單胞菌屬[14]、真菌[15]、鏈霉菌[16]等,其中草生歐文氏菌(Erwinia herbicola),弗氏檸檬酸菌(Citrobacter freundii)中的酪氨酸酚解酶活性較高。

    圖2 以愈創(chuàng)木酚為原料合成多巴

    圖3 酪氨酸酚解酶催化合成左旋多巴

    Lee 等[17]用來(lái)源于Symbiobacterium sp. SC-1 的酪氨酸酚解酶(TPL),將鄰苯二酚、丙酮酸和氨轉(zhuǎn)化為左旋多巴。反應(yīng)15 h 以后,左旋多巴的產(chǎn)量可以達(dá)到65 g/L,收率可達(dá)到92%。上述催化體系中,當(dāng)鄰苯二酚及丙酮酸的濃度較高時(shí)會(huì)對(duì)TPL 產(chǎn)生抑制作用甚至不可逆失活,在發(fā)酵體系中加入一些硼酸根離子可以減輕鄰苯二酚對(duì)酶的抑制作用[18]。然而該催化體系存在一些缺點(diǎn)[19],反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化效率不高、分離成本高、原料比較昂貴。

    3.2 酪氨酸酶法合成

    酪氨酸酶(tyrosinase)以酪氨酸直接作為底物,催化合成左旋多巴(圖4)。該酶同時(shí)具有單酚氧化酶和二酚氧化酶氧化還原作用,其中單酚氧化酶催化單酚羥基化,二酚氧化酶可將二酚類(lèi)化合物氧化為醌類(lèi)化合物。Krishnaveni 等[20]利用真菌Acremonium rutilum 轉(zhuǎn)化酪氨酸合成左旋多巴,該菌具有較高的酪氨酸酶生產(chǎn)能力,經(jīng)過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件后,連續(xù)培養(yǎng)120 h,最大產(chǎn)量是0.89 mg/mL。Ho 等[21]將來(lái)源于蘑菇的酪氨酸酶通過(guò)固定化的方法轉(zhuǎn)化合成左旋多巴。酪氨酸酶用聚苯乙烯-聚酰胺苯乙烯(PSNH)和聚甲基氯苯乙烯(PSCL)固定,催化的最適pH 值和最適溫度分別為5.5 和60 ℃、3.0 和70 ℃。反應(yīng)36 h 后,兩種固定化方式催化生成左旋多巴的產(chǎn)率分別為1.44 mg/(L·h)和2.33 mg/(L·h)。這兩種固定方式中,PSCL 上的酪氨酸酶穩(wěn)定性明顯高于PSNH。Ates 等[22]將酪氨酸酶固定 于含銅離子的海藻酸鈉中,運(yùn)用填充床酶法的方法生產(chǎn)左旋多巴,產(chǎn)量達(dá)1.2 mg/L。若在反應(yīng)體系中引入空氣,左旋多巴產(chǎn)量可以提高6.4 倍,左旋多巴生產(chǎn)效率達(dá)到110 mg/(L·h)。然而這一過(guò)程需要耗費(fèi)大量還原劑,同時(shí)產(chǎn)物左旋多巴不容易分離。

    圖4 酪氨酸酶催化酪氨酸合成L-DOPA

    由于酪氨酸酶具有二酚氧化還原酶的活性,會(huì)將左旋多巴繼續(xù)氧化生成多巴醌,為防止左旋多巴被氧化,可以引入化學(xué)還原劑,如抗壞血酸[21,23],NADH 或者羥胺[24],向多巴醌供應(yīng)電子使其重新還原為左旋多巴。Mina 等[25]對(duì)這一方法進(jìn)行了改進(jìn),將酪氨酸酶包被組成酪氨酸酶-碳納米-多吡咯電極,由電極供應(yīng)還原多巴醌的電子,左旋多巴的產(chǎn)率提高95.9%,達(dá)到27 mg/(L·h)。

    3.3 轉(zhuǎn)氨酶法合成

    轉(zhuǎn)氨酶(transaminase)可將L-天冬氨酸或L-谷氨酸中的氨基轉(zhuǎn)移到3,4-二羥基苯丙酮酸上,進(jìn)而生成左旋多巴(圖5)。Sandler 等[26]認(rèn)為在左 旋多巴中轉(zhuǎn)氨基作用是非常重要的一步。隨后Nagasaki 等[27-28]研 究 了 Enterobacter cloacae NB320,Alcaligenes faecalis 轉(zhuǎn)氨基作用生成左旋多巴的能力。然而由于轉(zhuǎn)氨作用存在諸多問(wèn)題,隨后相關(guān)利用轉(zhuǎn)氨酶生成左旋多巴的研究比較少見(jiàn)。

    圖5 轉(zhuǎn)氨基作用合成多巴

    4 代謝工程策略合成左旋多巴

    李華鐘等[29-30]將來(lái)源于Citrobacter freundii 的酪氨酸酚解酶基因?qū)氪竽c桿菌中進(jìn)行異源表達(dá),并對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化的反應(yīng)體系中添加了底物丙酮酸,鄰苯二酚及0.1%EDTA,0.2%亞硫酸鈉。氨水調(diào)節(jié)pH=8,15 ℃反應(yīng)16 h,左旋多巴的產(chǎn)量可達(dá)15.36 g/L。Katayama 等[4,31]對(duì)Erwinia herbicola 進(jìn)行代謝工程改造,合成左旋多巴。他們發(fā)現(xiàn)TyrR 是酪氨酸酚解酶基因的轉(zhuǎn)錄激活因子,通過(guò)隨機(jī)突變篩選得到TyrR 突變體TyrV67A Y72C E201G,提高酪氨酸酚解酶基因的表達(dá)量,進(jìn)而提高左旋多巴的生成。發(fā)酵末期左旋多巴產(chǎn)率由0.357 g/(L·h)提高到了11.l g/(L·h)。Kurt 等[32]將來(lái)源于Vitreoscilla 血紅素基因?qū)隒itrobacter freundii 和Erwinia herbicola 中,左旋多巴的產(chǎn)量分別由未導(dǎo)入之前的30.4 mg/L 和33.8 mg/L 提高到112 mg/L和97 mg/L。

    Munoz 等[33]改造大腸桿菌代謝通路合成左旋多巴。他們首先敲除葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶基因,增加磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤蘚糖的積累,為酪氨基酸合成提供足夠前體,結(jié)果顯示L-酪氨酸比生產(chǎn)速率提高3 倍。敲除酪氨酸合成代謝中的抑制因子基因,L-酪氨酸比生產(chǎn)速率提高1.9 倍。解除酪氨酸的反饋抑制,將代謝通量由磷酸烯醇式丙酮酸引向合成L-酪氨酸。進(jìn)一步通過(guò)表達(dá)分支酸變位酶基因和來(lái)源于 Zymomonas mobilis 的環(huán)己二烯脫羥酶基因,增大該代謝通路的通量。在基本鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵,左旋多巴比生產(chǎn)速率達(dá)13.6 mg/(g·h),得率為51.7 mg/g,在發(fā)酵罐中發(fā)酵結(jié)果顯示左旋多巴產(chǎn)量達(dá)1.51 g/L。

    5 總結(jié)和展望

    隨著我國(guó)人口老齡化速度的加快,左旋多巴的需求將迅速增加。隨著代謝工程、合成生物學(xué)的發(fā)展,天然產(chǎn)物藥物的異源生物合成已經(jīng)成為可能并受到越來(lái)越多的關(guān)注。由于化學(xué)合成和植物提取存在很多問(wèn)題,通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法合成左旋多巴是今后研究的重要方向。

    (1)開(kāi)發(fā)新型高效的生物酶催化體系,為生物轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支撐。挖掘新型高效催化合成左旋多巴相關(guān)酶,對(duì)已有酶進(jìn)行突變,高通量篩選高活性酶。探索高效酪氨酸酚解酶和酪氨酸酶的固定化方法,進(jìn)一步提高酶的壽命和使用周期。

    (2)運(yùn)用代謝工程和合成生物學(xué)的思路,從細(xì)胞整體角度,從頭設(shè)計(jì)左旋多巴的微生物合成途徑,探明左旋多巴生物合成中的限制因素,并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)改造,構(gòu)建高效生產(chǎn)左旋多巴的工程微生物。目前,植物來(lái)源的紫杉醇和青蒿素前體在大腸桿菌和酵母中得到高效合成,為左旋多巴工程菌創(chuàng)建具有示范價(jià)值。同時(shí)開(kāi)發(fā)新型左旋多巴的工程菌株,如在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了具有合成左旋多巴的基因,可改造使其具有較高的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

    (3)開(kāi)發(fā)新型左旋多巴衍生物的生物合成路線。左旋多巴的很多衍生物如甲基多巴、氧-甲基多巴、卡比多巴、左旋多巴酯、咪唑啉酮等均具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用。探索這些衍生物的生物轉(zhuǎn)化或者微生物合成路線也是今后研究的一個(gè) 方向。

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