大黃素對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝及其糖脂代謝紊亂的防治作用

張亞輝，周伏喜，盧放根

（1.永州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南永州425000；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南長(zhǎng)沙410011）

大黃素對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝及其糖脂代謝紊亂的防治作用

張亞輝1，周伏喜2，盧放根2

（1.永州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南永州425000；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南長(zhǎng)沙410011）

目的探討大黃素對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝及其糖脂代謝紊亂的防治作用。方法SD大鼠隨機(jī)分為A組和M組，分別予普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)；于4周末驗(yàn)證有脂肪肝后，M組再隨機(jī)分為B、C、D和E組，各大鼠飼養(yǎng)不變，其中，C、D、E組分別予低、高劑量大黃素、二甲雙胍干預(yù)。8周末測(cè)定肝指數(shù)、OGTT、轉(zhuǎn)氨酶、血脂及肝脂質(zhì)含量，評(píng)價(jià)肝臟脂肪變和炎癥程度。結(jié)果C、D組肝指數(shù)和血ALT、AST均較B組降低(P＜0.01)。大黃素可改善糖耐量(P＜0.01)。與B組比較，大黃素能降低血TC、TG、LDL及降低肝TC、TG含量(P＜0.01)，均有劑量依賴關(guān)系(P＜0.01)；同時(shí)D組血HDL較B組升高(P＜0.01)。與B組比較，C、D組大鼠肝臟脂肪變有不同改善(P＜0.05，P＜0.01)，而肝臟炎癥均有改善(P＜0.01)。結(jié)論大黃素具有改善大鼠非酒精性脂肪肝及其糖脂代謝紊亂的作用。

非酒精性脂肪肝；大黃素；高脂血癥；代謝綜合征

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)為目前臨床上最常見的慢性肝病之一。據(jù)研究[1]，它與高脂血癥、糖耐量異常、2型糖尿病、肥胖及高血壓病等代謝綜合征(Metabolic syndrome，MS)密切相關(guān)，而且當(dāng)它合并MS或MS組分后嚴(yán)重心腦血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，因此對(duì)NAFLD合并MS組分的防治具有非常重要的意義。本文通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝模型，進(jìn)一步探討大黃素對(duì)非酒精性脂肪肝及其代謝合并癥的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠42只，購(gòu)自上海斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，清潔級(jí)，體重(140±10)g。

1.2 主要試劑、儀器與藥品膽固醇由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司提供(批號(hào)：94K102100)；丙基硫氧嘧啶片由上海朝暉藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)：20081104)；豬膽酸納由北京市愛普華美生物科技有限公司提供(批號(hào)：20090312)；膽固醇、甘油三酯試劑盒購(gòu)自浙江東甌津瑪生物科技有限公司(批號(hào)：2009070044、2009060036)；日立7600-020型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本株式會(huì)社；大黃素由鄭州荔諾生物科技有限公司提供(批號(hào)：090316)，純度98%以上；二甲雙胍由北京中惠藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)：20081217)。

1.3 動(dòng)物造模、分組與給藥42只大鼠在清潔動(dòng)物房?jī)?nèi)單籠飼養(yǎng)，其控制條件為室內(nèi)溫度(20±2)℃，濕度(55±10)%，晝夜各12 h，自由飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，42只大鼠按體重大小以隨機(jī)方法分為正常組組(A組、8只)和高脂組(M組、34只)，其中A組和M組分別給于普通飼料和高脂飼料(即參照文獻(xiàn)[2]稍加改進(jìn)的高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料77.6%+豬油10%、蛋黃粉5%、蔗糖5%、膽固醇2%、膽鹽0.2%、丙硫氧嘧啶0.2%)喂養(yǎng)。第4周末隨機(jī)處死M組2只大鼠行肝臟HE染色病理學(xué)檢查，驗(yàn)證有肝臟脂肪變后，A組(8只)大鼠予0.5%羧甲基纖維素鈉(SCMC)10 ml·kg-1·d-1灌胃。剩余的32只M組大鼠又按體重大小隨機(jī)分為四組(每組8只)：B組(B組)、低劑量大黃素組(C組)、高劑量大黃素組(D組)和E組(E組)，其中，B組予0.5%SCMC 10 ml·kg-1·d-1灌胃，C、D組分別予大黃素20 mg·kg-1·d-1和40 mg·kg-1·d-1灌胃，E組予二甲雙胍150 mg·kg-1·d-1灌胃，大黃素和二甲雙胍均以0.5% SCMC溶解；各大鼠喂養(yǎng)飼料及方式均不變。

1.4 標(biāo)本采集與指標(biāo)測(cè)定第8周末大鼠禁食12 h，行糖耐量試驗(yàn)(OGTT)試驗(yàn)(0 h、1 h、2 h)，稱體重，麻醉后下腔靜脈取血分離血清后用生化儀測(cè)定血谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。取出肝臟，觀察肝臟外形，稱肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)：(肝濕重/體重)×100%。取適量肝右葉組織制備以氯仿:甲醇(1:1)混合液為介質(zhì)的10%肝組織勻漿，靜置、離心后取上清液檢測(cè)肝脂質(zhì)TC、TG含量，按相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。取適量右肝組織，置于10%甲醛溶液中固定后常規(guī)HE染色，光鏡下肝臟脂肪變程度計(jì)分方案[3]：＜5%肝細(xì)胞脂肪變(0分)；5%～30%肝細(xì)胞脂肪變(1分)；31%～50%肝細(xì)胞脂肪變性(2分)；51%～75%肝細(xì)胞脂肪變(3分)；75%以上肝細(xì)胞脂肪變(4分)。肝臟炎癥程度計(jì)分參照慢性肝炎的炎癥計(jì)分方案[4]：計(jì)分指標(biāo)共四項(xiàng)：匯管區(qū)炎癥(P)、小葉內(nèi)炎癥(L)、碎屑?jí)乃?PN)及橋接壞死(BN，包括多小葉壞死)；每項(xiàng)指標(biāo)按病變程度分別計(jì)分為1、2、3、4分；由于PN、BN的嚴(yán)重程度與病變活動(dòng)度和預(yù)后有直接關(guān)系，故在計(jì)分時(shí)加倍；肝臟炎癥程度計(jì)分公式為：P+L+2(PN+BN)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，如果資料為正態(tài)性、方差齊，則以方差分析及SNK檢驗(yàn)，否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 體重與肝指數(shù)各組間體重比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。B組肝指數(shù)較A組升高(P＜0.01)；C、D組和E組肝指數(shù)均較B組降低(P＜0.01)，見表1。

2.2 血清ALT和AST與A組比較，B組大鼠血清ALT和AST升高(P＜0.01)；大黃素治療后血清ALT、AST較B組降低(P＜0.01)，其中大黃素降低ALT有劑量依賴關(guān)系(P＜0.05)；而E組血清ALT、AST較B組亦降低(P＜0.01，P＜0.05)，但D組較E組降低ALT、AST更明顯(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠體重、肝指數(shù)及血清轉(zhuǎn)氨酶的比較（

表1 各組大鼠體重、肝指數(shù)及血清轉(zhuǎn)氨酶的比較（

注：與A組比較，bP＜0.05，aP＜0.01；與B組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與C組比較，eP＜0.05；與E組比較，fP＜0.01。

A組B組C組D組E組77.24±11.07 143.96±25.83a98.06±22.06bd83.64±23.52df116.10±17.15ac283.11±14.30 298.45±17.63 290.56±13.18 287.68±15.45 288.30±16.09 3.60±0.34 5.07±0.19a4.71±0.20d4.56±0.30d4.48±0.17d38.61±9.56 105.26±17.72a72.83±13.08ad58.30±12.53adfe82.98±11.00ad

2.3 各組OGTT測(cè)定結(jié)果比較空腹血糖在各組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各組大鼠予葡萄糖5 g/kg灌胃后1 h血糖有不同程度升高，其中，B組血糖較A組明顯升高(P＜0.01)；C、D組和E組血糖均較B組降低(P＜0.01)；于2 h時(shí)各組大鼠血糖不同程度恢復(fù)，其中，B組血糖仍較A組升高(P＜0.01)，C、D組和E組血糖較B組降低(P＜0.01)，見表2。

表2 各組大鼠OGTT結(jié)果(mmol/L，n=8)

表2 各組大鼠OGTT結(jié)果(mmol/L，n=8)

注：與A組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.01。

A組B組C組D組E組5.24±0.82 8.65±1.19a6.89±1.23ac7.00±0.74ac6.68±0.96ac4.20±0.65 4.54±0.61 4.40±0.59 4.29±0.60 4.10±0.61 7.13±0.75 10.14±1.63a8.39±1.12bc8.49±1.18bc8.53±0.95bc

2.4 各組血清TC、TG、LDL、HDL及肝脂質(zhì)TC、TG含量比較B組大鼠血清TC、TG、LDL及肝TC和TG含量均較A組升高(P＜0.01)，而大鼠血清HDL較A組降低(P＜0.01)；C、D組血清TC、TG、LDL及肝TC和TG含量較B組均降低(P＜0.01)，以D組降低更明顯(P＜0.05)；E組血清LDL較B組降低(P＜0.01)，肝TC和TG含量較B組、C組降低(P＜0.01)；D組血清HDL較B組、C組升高(P＜0.01，P＜0.05)，見表3。

2.5 肝臟病理改變

2.5.1 大體病理改變A組肝臟形態(tài)大小正常，表面光滑細(xì)膩，邊緣銳利，色澤紅潤(rùn)。B組肝臟形態(tài)飽滿，體積稍增大，表面粗糙有顆粒感，邊緣較鈍，色澤以土黃色為主。大黃素、二甲雙胍治療后肝臟表面、邊緣、色澤等大體病理改變較B組有不同程度改善。

2.5.2 光鏡下肝組織HE染色改變A組大鼠肝臟無(wú)脂肪變及炎癥改變。B組大部分肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性，肝竇受壓變小、甚至消失，以小葉周邊部更為明顯；肝小葉邊界不清，匯管區(qū)有不同程度炎癥形成。大黃素及二甲雙胍治療后肝臟脂肪變及炎癥程度較B組有好轉(zhuǎn)，其中，C、D組和E組肝臟脂肪變計(jì)分較B組有不同程度降低(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，而且肝臟炎癥亦較B組有不同程度改善(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)。見表4。

表3 各組大鼠血清脂質(zhì)及10%肝勻漿肝脂質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果(mmol/L，n=8)

表3 各組大鼠血清脂質(zhì)及10%肝勻漿肝脂質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果(mmol/L，n=8)

注：與A組比較，aP＜0.01；與B組比較，bP＜0.01；與C組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與E組比較，eP＜0.01。

組別A組B組C組D組E組血清HDL 1.03±0.08 0.79±0.16a0.82±0.09 0.96±0.11bc0.88±0.12血清TC 1.74±0.39 10.78±1.28a6.63±1.38be5.13±1.25bce9.59±1.40血清TG 0.60±0.10 1.36±0.11a1.14±0.08be1.01±0.11bde1.29±0.07肝脂質(zhì)TC 0.62±0.13 6.38±0.43a3.61±0.47be2.44±0.44bd2.18±0.31b肝脂質(zhì)TG 1.29±0.19 4.78±0.57a3.28±0.48be2.17±0.54bd2.03±0.38b血清LDL 0.96±0.11 2.86±0.25a2.11±0.16be1.92±0.11bce2.47±0.21b

表4 各組大鼠肝臟組織脂肪變程度計(jì)分和炎癥活動(dòng)度計(jì)分，n=8)

表4 各組大鼠肝臟組織脂肪變程度計(jì)分和炎癥活動(dòng)度計(jì)分，n=8)

注：與A組比較，aP＜0.01；與B組比較，bP＜0.05cP＜0.01。

組別A組B組C組D組E組炎癥活動(dòng)度計(jì)分0.00±0.00 3.13±0.99a1.88±0.83c1.50±0.76c2.13±0.83b脂肪變程度計(jì)分0.00±0.00 3.63±0.52a2.75±0.71b2.50±1.07c2.38±0.74c

3 討論

動(dòng)物模型在研究NAFLD的發(fā)病機(jī)理及藥物評(píng)價(jià)方面有重要作用。本實(shí)驗(yàn)以稍加改進(jìn)的高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠后于第8周末B組肝臟呈中重度脂肪變，以重度為主，并伴一定炎癥，出現(xiàn)肝指數(shù)、轉(zhuǎn)氨酶及肝脂質(zhì)含量增高，糖耐量異常，血脂異常等改變，證實(shí)成功復(fù)制了大鼠非酒精性脂肪肝模型并伴糖脂代謝紊亂。

據(jù)研究，NAFLD的治療意義不僅在于逆轉(zhuǎn)或減輕脂肪肝，阻止脂肪性肝炎的發(fā)生與進(jìn)展，減少肝病殘疾和死亡；而且還重在控制代謝紊亂，減少M(fèi)S相關(guān)組分或心腦血管事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，而藥物無(wú)疑是NAFLD重要治療措施。大黃素是大黃等中藥的主要有效單體成分，化學(xué)名為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，用于防治脂肪肝及其代謝合并癥的報(bào)道較少見。本研究顯示大黃素治療后大鼠肝臟脂肪變及炎癥均有明顯好轉(zhuǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了大黃素防治NAFLD有效，此結(jié)果與文獻(xiàn)[5]的報(bào)道相近。本實(shí)驗(yàn)顯示大黃素及二甲雙胍均可降低肝指數(shù)，提示此二藥均有減少肝臟脂肪含量和內(nèi)臟性肥胖的作用，而這可提高胰島素敏感性，減少脂肪肝發(fā)生的一次打擊[6]。

本研究顯示高脂飼料喂養(yǎng)大鼠后出現(xiàn)了轉(zhuǎn)氨酶升高，提示高脂飲食可使脂肪肝大鼠產(chǎn)生肝細(xì)胞損傷及炎癥；而且有研究報(bào)道NAFLD伴轉(zhuǎn)氨酶升高使2型糖尿病和MS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加[7]。本實(shí)驗(yàn)示大黃素治療后脂肪肝大鼠血清ALT、AST降低，說(shuō)明大黃素具有修復(fù)肝細(xì)胞損傷及炎癥，改善肝功能的作用；其機(jī)制可能與大黃素改善脂肪肝大鼠腸道屏障功能、降低腸源性內(nèi)毒素吸收、抑制炎癥等有關(guān)[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)顯示大黃素有降低餐后血糖、改善糖耐量的作用，其作用近似二甲雙胍，其機(jī)制可能與大黃素具有提高胰島素敏感性[10]有關(guān)，這有待進(jìn)一步研究。

NAFLD與脂質(zhì)代謝紊亂關(guān)系密切，而且有研究示NAFLD患者進(jìn)食后形成的高脂血癥可能促使動(dòng)脈粥樣硬化加快形成[11]，由此促進(jìn)心腦血管疾病的發(fā)生。而大黃素具有降低大鼠血清TC、TG、LDL及肝TC、TG含量的作用，同時(shí)升高血HDL的作用，說(shuō)明大黃素有改善脂質(zhì)代謝紊亂的作用，但其具體機(jī)制有待研究。

[1]余藝,傅曉英,周昭遠(yuǎn)，等.脂肪肝及其腹圍與代謝綜合征的相關(guān)性研究[J].海南醫(yī)學(xué),2011,22(18):13-16.

[2]胡克章,楊坤,黃正明.高糖高脂肪飼料誘導(dǎo)大鼠非酒精性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2009,25(2):136-138.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組.非酒精性脂肪性肝病診療指南[J].中華肝臟病雜志,2006,14(3):161-163.

[4]王泰齡,劉霞,周元平,等.慢性肝炎炎癥活動(dòng)度及纖維化程度計(jì)分方案[J].中華肝臟雜志,1998,66(4):195-197.

[5]Dong H,Lu FE,Gao ZQ,et al.Effects of emodin on treating murine nonalcoholic fatty liver induced by high caloric laboratory chaw[J].World J Gastroenterol,2005,11(9):1339-1344.

[6]Moore JB.Non-alcoholic fatty liver disease:the hepatic consequence of obesity and the metabolic syndrome[J].Proc Nutr Soc, 2010,69(2):211-220.

[7]Adams LA,Waters OR,Knuiman MW,et al.NAFLD as a risk factor for the development of diabetes and the metabolic syndrome:an eleven-year follow-up study[J].Am J Gastroenterol,2009,104(4): 861-867.

[8]章文,朱清靜.大黃藥理研究及其在肝病治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2008,18(2):126-129.

[9]Dong MX,Jia Y,Zhang YB,et al.Emodin protects rat liver from CCl(4)-induced fibrogenesis via inhibition of hepatic stellate cells activation[J].World J Gastroenterol,2009,15(38):4753-4762.

[10]王慧蓮,王琦,尹春梅.大黃素和小檗堿改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制研究[J].中國(guó)病理生理雜志,2009,25(10):2044-2046.

[11]Musso G,Gambino R,De Michieli F,et al.Dietary habits and their relations to insulin resistance and postprandial lipemia in nonalcoholic steatohepatitis[J].Hepatology,2003,37(4):909-916.

Effect of emodin on nonalcoholic fatty liver disease and its disturbance in the lipid and glucose metabolism in rat

ZHANG Ya-hui1,ZHOU Fu-xi2,LU Fang-gen2.Department of Gastroenterology，the Central Hospital of Yongzhou，Yongzhou 425000，Hunan,CHINA;2.Department of Gastroenterology,the Second Xiangya Haspital of Central South University,Changsha 410011,Hunan,CHINA

ObjectiveTo observe the effect of emodin on NAFLD and its disorder of glucose-lipid metabolism.MethodsSD rats were randomly divided into group A and M,which were separately fed with ordinary diets and high fat diets.Four weeks later,when hepatic steatosis were identified,group M were indvided randomly into group B,C,D and E.All feeding were unchanged.Group C,D and E were separately intervened with emodin by low doses,emodin by high doses and metformin.Four weeks later,the liver indexs and OGTT were observed.The serum transaminase,lipid and hepaticlipid were measured.The degree of steatosis and inflammation of liver were evaluated. ResultsThe liver indexs,the serum ALT and AST in group C and D were lower than those in group B(P＜0.01).The sugar tolerance in rats were improved(P＜0.01).The emodin reduced serum TC,TG,LDL and hepaticlipid(P＜0.01), increased serum HDL(P＜0.01),and the effect had a dose-dependent(P＜0.01).The steatosis and hepatic inflammatory activity were reduced(P＜0.05,P＜0.01).ConclusionThe emodin is effective to treat the NAFLD,and can correct its disorder of glucose-lipid metabolism.

Nonalcoholic fatty liver disease;Emodin;Hyperlipemia;Metabolic syndrome

R-332

A

1003—6350(2013)05—0636—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.05.0274

2012-09-20)

張亞輝。E-mail：2008zhangyahui@163.com