Beclin1和LC3在乳腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)

周國華，姚維深，張旭

（1.南海人民醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院胸外科，廣東佛山528200；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心胸外科，廣東廣州510060）

Beclin1和LC3在乳腺導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)

周國華1，姚維深1，張旭2

（1.南海人民醫(yī)院、南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院胸外科，廣東佛山528200；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心胸外科，廣東廣州510060）

目的探討B(tài)eclinl和LC3在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及兩者的相關(guān)性。方法免疫組織化學(xué)EnVision法檢測50例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌及相應(yīng)癌旁組織的Beclin1和LC3表達(dá)，分析其臨床意義。結(jié)果乳腺癌組織Beclin1陽性表達(dá)率[44%(22/50)]明顯低于癌旁組織[100%(50/50)]，LC3陽性表達(dá)率[40%(20/50)]明顯低于癌旁組織[92%(46/50)]；Beclin1和LC3表達(dá)均與患者病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P＜0.05)，而與患者年齡、絕經(jīng)狀況、乳頭侵犯及患者ER、PR依賴性無關(guān)(P＞0.05)；Pearson相關(guān)性分析顯示兩者在乳腺癌中的表達(dá)無相關(guān)性。結(jié)論乳腺導(dǎo)管癌組織中LC3和Beclin1陽性表達(dá)率低于癌旁組織，兩者可能均與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

乳腺癌；乳腺浸潤性導(dǎo)管癌；Beclin1；LC3

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，發(fā)生率占女性所有腫瘤的31%，乳腺導(dǎo)管癌是乳腺癌常見的病理類型。自噬基因Beclinl是哺乳動物細(xì)胞中酵母ATG6基因的同源物，與磷脂酰肌醇-3-激酶（PIK3C3或Vps34）形成自噬體，在調(diào)節(jié)自噬活性參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1]。Beclinl基因的缺失可導(dǎo)致自噬空泡形成減少，明顯增加上皮性和造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生。微管相關(guān)蛋白LC3是酵母ATG8基因同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬體的形成[2]。本研究中我們采用免疫組織化學(xué)方法檢測Beclin1、LC3在乳腺導(dǎo)管癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，探討B(tài)eclin1和LC3在乳腺導(dǎo)管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料以2009年1月至2011年8月在南方醫(yī)學(xué)大學(xué)附屬南海醫(yī)院病理科確診的50例乳腺癌組織標(biāo)本為研究對象，所選標(biāo)本均具有完整的臨床和病理資料，且術(shù)前均未進(jìn)行放化療?；颊吣挲g30～76歲，平均(47±8)歲。依惡性腫瘤UICC TNM第六版分類標(biāo)準(zhǔn)，TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期14例，Ⅲ期13例，Ⅳ期3例；病理分級：Ⅰ級22例，Ⅱ級13例，Ⅲ級15例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例；年齡＞45歲患者23例，年齡≤45歲患者27例；已絕經(jīng)患者22例，未絕經(jīng)患者28例；發(fā)生乳頭侵犯患者24例，未發(fā)生侵犯患者26例。取與標(biāo)本對應(yīng)的同期癌旁組織（癌邊緣≥5 cm處）作為對照組，所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。

1.2 免疫組化EnVision法Beclin1鼠抗人單克隆抗體和免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋后4 μm厚連續(xù)切片后進(jìn)行染色。染色步驟按試劑盒要求進(jìn)行。采用雙盲法隨機選取10個高倍視野(×400)，每個高倍視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞。觀察陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)及染色強度。對陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)計分，以百分?jǐn)?shù)＜5%=0、5%～25%=1、26%～50%=2、51%～75%=3、＞75=4。同時以染色強度無色=0、淡黃色=1、棕黃色=2、深棕色=3進(jìn)行評分。最后累積積分大于3分為陽性表達(dá)，否則視為陰性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。配對資料的關(guān)聯(lián)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)來描述，P＞0.05為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1和LC3在乳腺組織中的表達(dá)Beclin1主要表達(dá)于細(xì)胞漿，少量或微量表達(dá)于細(xì)胞膜，LC3主要表達(dá)于細(xì)胞漿。Beclin1和LC3在乳腺組織中的表達(dá)情況見表1。50例乳腺癌組織標(biāo)本中Beclin1陽性表達(dá)率為44%，顯著低于癌旁組織的100%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=38.89，P＜0.01)。癌組織中LC3陽性表達(dá)率為40%，顯著低于癌旁組織92%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=30.12，P＜0.01)。

表1 Beclin1和LC3在乳腺組織中的表達(dá)[例(%)，n=50]

2.2 Beclin1和LC3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系不同病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況之間Beclin1和LC3表達(dá)均存在顯著差異，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。病理分級Ⅰ級Beclin1陽性表達(dá)率均明顯高于Ⅱ～Ⅲ級(χ2=9.33，P＜0.01)，Ⅰ級LC3陽性表達(dá)率明顯高于Ⅱ～Ⅲ級(χ2=5.97，P＜0.05)；臨床分期Ⅰ期Beclin1陽性表達(dá)率明顯高于Ⅱ～Ⅳ期(χ2=5.97，P＜0.05)，Ⅰ期LC3陽性表達(dá)率明顯高于Ⅱ～Ⅳ期(χ2=12.15，P＜0.01)；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Beclin1陽性表達(dá)率明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(χ2=4.88，P＜0.05)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者LC3陽性表達(dá)率明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(χ2=5.56，P＜0.05)。癌組織中Beclin1和LC3陽性表達(dá)在不同患者年齡、絕經(jīng)狀況和乳頭侵犯差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 Beclin1和LC3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Beclin1和LC3相關(guān)性分析Beclin1和LC3共同陽性患者10例，共同陰性者18例，LC3陽性而Beclin1陰性表達(dá)者10例，Beclin1陽性而LC3陰性者12例，Pearson相關(guān)性分析顯示，兩者在乳腺癌中的表達(dá)無相關(guān)性(χ2=0.49，r=0.069，P＞0.05)。

3 討論

自噬是細(xì)胞利用溶酶體消化降解自身受損、變性或衰老的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的生理過程[3]。在正常生理過程中，自噬有利于細(xì)胞廢物清除、結(jié)構(gòu)重建和生長分化；在應(yīng)急狀態(tài)下，自噬是細(xì)胞對不良環(huán)境的一種防御機制，可有效防止有毒或致癌損傷蛋白質(zhì)或細(xì)胞器的積累抑制細(xì)胞癌變；在細(xì)胞發(fā)生癌變過程中，自噬為癌細(xì)胞生長提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)腫瘤生長。因此，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要的角色[4]。Beclin1與LC3都參與了細(xì)胞自噬活性的調(diào)節(jié)。Beclinl是酵母ATG6基因同源物與PIK3C3或Vps34參與形成自噬體。LC3是酵母ATG8基因同源物定位于前自噬泡和自噬泡膜表面參與自噬體形成。LC3的表達(dá)強度與自噬泡的數(shù)量成正相關(guān)，被認(rèn)為是自噬體的標(biāo)志分子[2]。Beclinl已被認(rèn)為在調(diào)節(jié)自噬活性參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。國內(nèi)李捷等[5]通過免疫組織芯片、免疫組織化學(xué)和Western blot法檢測胃癌及相應(yīng)癌旁組織發(fā)現(xiàn)癌組織Beclinl低表達(dá)(P＜0.05)，且胃癌組織中Beclinl低表達(dá)均與患者性別、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及疾病分期有關(guān)(P＜0.05)。LC3表達(dá)是否與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)還存在爭議，眭怡群等[6]通過組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法檢測115例大腸癌中LC3表達(dá)發(fā)現(xiàn)，大腸癌中LC3陽性率高于大腸腺瘤和正常大腸黏膜(P＜0.01)，且與大腸癌的組織學(xué)分化程度相關(guān)(P＜0.05)。此外，趙軒一等[7]報道口腔鱗狀細(xì)胞癌LC3陽性率為29.79%，顯著低于癌旁組織的62.5%，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P＜0.05)。程海燕等[8]報道宮頸鱗癌LC3陽性率為51.6%，顯著低于正常宮頸組織，并與腫瘤分化和復(fù)發(fā)相關(guān)(P＜0.05)。國外Othman等[9]通過免疫組織化學(xué)檢測67例乳腺癌組織發(fā)現(xiàn)人類LC3兩個亞型LC3A和LC3B在乳腺癌組織中的表達(dá)有所差異，其中LC3A在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于LC3B，并認(rèn)為LC3A可能在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中扮演更重要的角色。國內(nèi)吳妍等[10]采用免疫組織化學(xué)和RT-PCR技術(shù)檢測40例乳腺浸潤性癌和10例乳腺非浸潤性癌時，也驗證了正常乳腺組織乳腺增生性病變?nèi)橄俜墙櫺园┖徒櫺园?組病例中LC3A和LC3B均有不同程度的高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。且在乳腺癌Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級中LC3A表達(dá)依次呈遞增趨勢，也認(rèn)為LC3A可能在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

本研究中我們檢測了50例乳腺導(dǎo)管癌LC3和Beclin1表達(dá)發(fā)現(xiàn)癌組織中LC3和Beclin1陽性表達(dá)率顯著低于癌旁組織，且與組織病理分級、患者臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P＜0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示，兩者在乳腺癌中的表達(dá)無相關(guān)性。

綜上所述，本研究初步揭示了乳腺導(dǎo)管癌自噬相關(guān)基因LC3和Beclin1表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究自噬活性調(diào)節(jié)機制與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供重要方法和途徑。

[1]Koneri K,Goi T,Hirono Y,et al.Beclin1 gene inhibits tumor growth in colon cancer cell lines[J].Anticancer Res,2007,27:1453-1457.

[2]Kuma A,Matsui M,Mizushima N.LC3,an autophagosome marker canbeincorporatedintoproteinaggregatesindependentof autophag:caution in the interpretation of LC3 localization[J]. Autophagy,2007,3(4):323-328.

[3]Klionsky DJ,Emr SD.Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation[J].Science,2000,290(5497):1717-1721.

[4]Choi KS.Autophagy and cancer[J].Exp Mol Med,2012,44(2): 109-120.

[5]李捷,于觀貞,王杰軍,等.Beclin1和PTEN蛋白在胃癌中的表達(dá)及預(yù)后價值[J].中華消化雜志,2012,32(3):170-174.

[6]眭怡群,馮一中.自噬相關(guān)基因LC3、Beclin-1與凋亡相關(guān)基因p53、BCL-2在大腸癌中的表達(dá)及意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2012,28(3):282-286.

[7]趙軒一,張澤兵,白宇,等.自噬相關(guān)基因Beclin1和MAP1LC3在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2012,28 (1):60-64.

[8]程海燕,張彥娜,吳秋良,等.宮頸癌組織LC3表達(dá)及其臨床意義的研究[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(16):1247-1251.

[9]Othman EQ,Kaur G,Mutee AF.Immunohistochemical expression of MAP1LC3A and MAP1LC3B protein in breast carcinoma tissues[J].Journal of Clinical Laboratory Analysis,2009,23(4): 249-258.

[10]吳妍,范欽和.乳腺癌中微管相關(guān)蛋白LC3A和LC3B的表達(dá)及意義[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2011,27(6):615-619.

Expression of Beclin1 and LC3 in the tissue of invasive ductal carcinoma

ZHOU Guo-hua1,YAO Wei-shen1,

ZHANG Xu2.1.Department of Cardiothoracic Surgery,Nanhai People's Hospital,Nanhai Hospital Affiliated to Nanfang Medical University,Foshan 528200,Guangdong,CHINA;2.Department of Cardiothoracic Surgery,Sun Yat-Sen University Cancer Center,Guangzhou 510060,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of Beclin1 and LC3 in the tissue of invasive ductal carcinoma(IDC)and to evaluate the relationship of them.MethodsImmunohistochemical method was used to determine the expression of Beclin1 and LC3 protein in 50 patients of IDC and nearby mucosa of the carcinoma.The relationship between the gene expression and clinicopathological features was analyzed.ResultsThe positive expression rate of Beclin1 in IDC(44%,22/50)was significantly lower than that in nearby mucosa of the carcinoma(100%,50/50). The positive expression rate of LC3 in IDC(40%,20/50)was significantly lower than that in nearby mucosa of the carcinoma(92%,46/50).The expression of Beclin1 and LC3 were correlated with the clinicopathological features,tissue types and neck lymph node metastasis in IDC(P＜0.05),but showed no correlation with ages,menopausal status,nipple infringement status,and the patients'ER and PR dependence(P＞0.05).The expression of Beclin1 was not correlated with the expression of LC3.ConclusionExpression of Beclin1 and LC3 is down-regulated in IDC tissues,which might be related to the tumorigenesis and development of IDC.

Breast cancer;Invasive ductal carcinoma;Beclin1;LC3

R737.9

A

1003—6350（2013）05—0630—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.05.0272

2012-10-28）

佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項目（編號：201208135）

姚維深。E-mail：yms7310@yahoo.com.cn