谷氨酸功能膠束溫和催化水解甲基-β-D-纖維二糖苷

劉 瑩 孟祥光 于衛(wèi)峰 李小紅 彭 肖

(四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院,綠色化學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610064)

1 引言

纖維素是目前地球上最豐富的可再生資源,將其轉(zhuǎn)化為化學(xué)品或生物燃料對(duì)解決目前人類所面臨的能源枯竭、資源匱乏及環(huán)境污染等問(wèn)題具有非常重要的意義.葡萄糖是一種能夠生產(chǎn)生物燃料、化學(xué)品以及高分子的重要平臺(tái)化合物,1,2例如葡萄糖的發(fā)酵可以產(chǎn)生乙醇、乳酸、3-羥基丙酸等重要的化合物.故而纖維素水解為糖類化合物被認(rèn)為是生物質(zhì)開(kāi)發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵瓶頸之一,3是當(dāng)前纖維素開(kāi)發(fā)利用的難題,發(fā)展有效的方法來(lái)水解纖維素得到葡萄糖是綠色化學(xué)領(lǐng)域最有吸引力和挑戰(zhàn)性的工作之一.3-6目前對(duì)纖維素的水解研究主要集中在無(wú)機(jī)酸7和生物酶8,9的催化水解上.無(wú)機(jī)酸水解纖維素的效率高、溫度低、副產(chǎn)物少,然而它也存在著難以克服的缺點(diǎn):酸回收困難、設(shè)備腐蝕大、成本高、產(chǎn)物難分離和環(huán)境問(wèn)題等.近年來(lái)一些研究小組對(duì)此加以改進(jìn),通過(guò)制備固體酸作催化劑,在水或離子液體中水解纖維素得到低聚糖和葡萄糖,10-13這樣的催化體系能夠克服無(wú)機(jī)酸催化的大多數(shù)缺點(diǎn),然而也存在效率低、溫度較高(＞150°C)、副產(chǎn)物多以及酸基團(tuán)流失等問(wèn)題.6纖維素水解酶可以在溫和條件下將纖維素選擇性地水解為低聚糖,進(jìn)而水解為葡萄糖.纖維素水解酶主要分為三類:外切酶(cellobiohydrolases)、內(nèi)切酶(endoglucanases)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases).14β-葡萄糖苷酶通過(guò)剪切低聚糖或纖維二糖的β-1,4-糖苷鍵來(lái)產(chǎn)生葡萄糖.它的催化機(jī)理被認(rèn)為是“雙羧酸”催化,酶的活性區(qū)域的兩個(gè)谷氨酸殘基是β-葡萄糖苷酶主要的催化基團(tuán).催化過(guò)程主要涉及糖酯化和酯水解兩個(gè)步驟:15,16酶的谷氨酸殘基上的一個(gè)羧酸作為質(zhì)子供體,與底物糖苷鍵上的氧原子形成氫鍵,同時(shí)另一個(gè)谷氨酸殘基上的羧酸陰離子作為親核試劑來(lái)進(jìn)攻糖苷鍵中的端基碳,形成一個(gè)酶-糖中間體,這個(gè)過(guò)程是糖苷鍵的剪切過(guò)程,被認(rèn)為是酶催化水解反應(yīng)的限速步驟;隨后為中間體的水解過(guò)程,釋放出葡萄糖和谷氨酸殘基,從而完成一個(gè)催化循環(huán).纖維二糖作為纖維素的結(jié)構(gòu)單元,已成為研究糖苷鍵催化水解的常用底物,然而由于它的化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定,對(duì)其催化水解的研究目前主要集中在β-葡萄糖苷酶的催化水解方面.17-20而β-葡萄糖苷酶的提取純化困難、價(jià)格昂貴、容易失活.因此,設(shè)計(jì)和制備出具有酶的溫和使用條件、選擇性高、環(huán)境友好,又具有化學(xué)穩(wěn)定性和高催化活性的β-葡萄糖苷模擬酶,研究其催化水解糖苷鍵的作用,對(duì)纖維素的降解以及天然酶的作用機(jī)理研究都具有重要的理論和實(shí)際意義.

功能性膠束作為一種新的自組裝超分子體系既能模擬酶的活性中心又能模擬酶的疏水微環(huán)境而引起了化學(xué)家和生物學(xué)家的廣泛關(guān)注.21-23膠束作為一個(gè)很好的超分子體系也被廣泛應(yīng)用于反應(yīng)的催化24,25和新材料的合成26,27上.在以前的研究中,我們?cè)媚z束來(lái)模擬核酸水解酶,28,29發(fā)現(xiàn)膠束的功能基團(tuán)和膠束的特殊微環(huán)境對(duì)催化水解起重要影響.據(jù)目前的報(bào)道,普遍認(rèn)為Cel7A是一種常見(jiàn)的纖維素酶,在它的催化活性區(qū)域有兩個(gè)重要的谷氨酸殘基,它們?cè)诖呋饫w維素糖苷鍵的過(guò)程中對(duì)纖維素水解酶的“雙酸作用”催化機(jī)理起了關(guān)鍵的作用.30-32基于此,本文設(shè)計(jì)合成了一種含有谷氨酸殘基的長(zhǎng)鏈烷基表面活性劑,首次研究了膠束體系對(duì)纖維素模型物甲基-β-D-纖維二糖苷的催化水解作用.考察不同氨基酸殘基對(duì)甲基-β-D-纖維二糖苷催化水解的影響.通過(guò)研究一系列膠束體系對(duì)糖苷鍵的催化水解情況,借以考察溫和條件(T＜130°C,近中性)下催化體系的活性中心和膠束的微環(huán)境對(duì)糖苷鍵斷裂的影響.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

纖維二糖(98%)從J&K Corp.購(gòu)買;氯化鈉(99.5%),硫酸(98%),3,5-二硝基水楊酸(98%),氫氧化鈉(96%),酒石酸鉀鈉(99%),苯酚(98%),亞硫酸鈉(99%),L-谷氨酸(98%),L-組氨酸(98.5%),葡萄糖(99%),果糖(99%),十二醛(99%),硼氫化鈉(97%),硫酸銅(99%),無(wú)水硫酸鈉(99%),氘代二甲基亞砜(99.8%),甲醇(99%),乙醇(99.7%),鹽酸(37%),丙酮(99.5%)和乙酸乙酯(99.5%)均為市售分析純?cè)噭?

1H NMR通過(guò)Bruker 200型或400型核磁共振儀記錄(瑞士Bruker公司);13C NMR通過(guò)Bruker 100型核磁共振儀記錄(瑞士Bruker公司);MOD 1106元素分析儀(意大利Carlo Erba公司);UV-5300型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);pHs-3C數(shù)字酸度計(jì)(上海虹益儀器廠);DDS-307電導(dǎo)儀(上海精密儀器有限公司);高效液相色譜(HPLC)(美國(guó)Waters公司,Waters 1525).

2.2 甲基-β-D-纖維二糖苷(MCB)的合成

甲基-β-D-纖維二糖苷(MCB)的合成參考文獻(xiàn)33的方法.改進(jìn)的合成步驟如下.

0.5 g纖維二糖加入到30 mL的甲醇溶液中,通入HCl氣體直至飽和為止.將反應(yīng)溫度升高到110°C,回流1 h.當(dāng)溶液中的固體剛好完全溶解時(shí),取幾滴反應(yīng)液加入斐林試劑中,在沸水中加熱1 min溶液不變紅則說(shuō)明纖維二糖已轉(zhuǎn)化為甲基-β-D-纖維二糖苷.用30%的NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至8-9,此時(shí)溶液變渾濁,有大量的白色固體析出,過(guò)濾,用甲醇洗滌固體三次,保留濾液.濃縮濾液,過(guò)硅膠柱分離產(chǎn)物.加入無(wú)水Na2SO4干燥溶液,過(guò)濾,真空旋干溶劑,得到白色固體,產(chǎn)率60%.1H NMR(400 MHz,DMSO(二甲基亞砜)-d6):δ5.16(d,1H),5.10(d,1H),4.94(d,1H),4.92(d,1H),4.63(br,1H),4.54(m,2H),4.26(d,1H),4.10(d,1H),3.76-3.67(2H),3.60(m,1H),3.41(m,1H),3.39(s,3H),3.31-3.21(3H),3.21-3.11(2H),3.05(m,1H),3.04-2.97(2H);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6):δ103.5,103.1,80.3,76.7,76.3,74.9,74.6,73.2,73.0,70.1,61.0,60.5,56.0.

2.3 Nα-十二烷基-L-谷氨酸的制備

將谷氨酸(1.4713 g,10 mmol)加入到不斷攪拌的甲醇(30 mL)溶液中,滴入數(shù)滴飽和的甲醇氯化氫溶液,使谷氨酸完全溶解.用NaOH固體(0.42 g)調(diào)節(jié)溶液的pH至8-9.然后滴加十二醛(3.11 mL,14 mmol)的乙醇溶液,滴加完畢后反應(yīng)液在40°C下反應(yīng)10 h后溶液冷卻至0°C,分批加入NaBH4固體顆粒(0.49 g,13.0 mmol),在0°C下反應(yīng)12 h,直到溶液淡紅色褪去.將反應(yīng)溶液過(guò)濾,減壓蒸去溶劑,所剩固體用乙酸乙酯溶解,用飽和的NaCl溶液洗滌2-3次,減壓蒸去乙酸乙酯.將所得固體用丙酮溶解,用37%的濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至谷氨酸的等電點(diǎn).此時(shí)產(chǎn)物析出.用丙酮洗滌產(chǎn)物3-4次,收集產(chǎn)物,置于干燥器中干燥.產(chǎn)率為43%.1H NMR(200 MHz,D2O-NaOH,δ):0.69(t,J=7.2 Hz,3H,CH3),0.96-1.37(m,22H,11CH2),1.40-1.77(m,2H,*CHCH2),1.82-2.10(m,2H,COCH2),2.13-2.41(m,2H,NCH2),2.81(dd,J1=8.1 Hz,J2=5.6 Hz,1H,*CH).C17H33NO4元素分析計(jì)算值(%):C,64.73;H,10.54;N,4.44;實(shí)測(cè)值(%):C,64.72;H,10.56;N,4.42.

2.4 MCB的水解

室溫下,將含有一定量催化劑的溶液調(diào)到所需的pH值,氮?dú)獗Ｗo(hù)下將溫度升高到90°C,此時(shí)溶液的pH會(huì)有較小的變化,用硫酸/氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH到所需要的值.加入底物MCB開(kāi)始反應(yīng).10 h后,將反應(yīng)液從反應(yīng)器中取出,冷卻至室溫.用4 mol·L-1的NaOH溶液將反應(yīng)液的pH調(diào)至13,常溫放置10 h后測(cè)定葡萄糖的含量.在反應(yīng)過(guò)程中,反應(yīng)液的pH用硫酸/氫氧化鈉來(lái)調(diào)節(jié),保持反應(yīng)液的pH值基本不變.

膠束與氨基酸復(fù)配體系的配制:在膠束溶液中加入一定量的氨基酸穩(wěn)定一定時(shí)間,得到膠束的復(fù)配體系.

2.5 分析方法

3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)是定量分析還原糖含量的常用方法.34,35本文中,我們把纖維二糖制成沒(méi)有還原性的MCB,從而可以方便地用DNS法來(lái)測(cè)定產(chǎn)物葡萄糖.

反應(yīng)溶液中生成的葡萄糖含量用DNS法或高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定.所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均扣除MCB在相同條件下自發(fā)水解所產(chǎn)生的葡萄糖含量.每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為平行三次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值,其標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%.

3 結(jié)果與討論

3.1 Nα-十二烷基-L-谷氨酸(L)的臨界膠束濃度的測(cè)定

表面活性劑Nα-十二烷基-L-谷氨酸(L)的臨界膠束濃度用電導(dǎo)法測(cè)定.圖1所示為溶液電導(dǎo)率(κ)與表面活性劑濃度(cL)的關(guān)系圖.從圖中可看出κ-cL直線有兩個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn),對(duì)應(yīng)的濃度分別為2.07×10-5和1.71×10-4mol·L-1,即Nα-十二烷基-L-谷氨酸的兩個(gè)臨界膠束濃度(cmc)分別為2.07×10-5和1.71×10-4mol·L-1,這可能是由于Nα-十二烷基-L-谷氨酸在水溶液中隨著濃度的不同而存在兩種不同的膠束形態(tài)所致.

3.2 MCB水解的紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)分光光度分析方法

纖維二糖是構(gòu)成纖維素的基本結(jié)構(gòu)單元,研究糖苷鍵的水解斷裂對(duì)纖維素的選擇性水解研究意義重大.然而由于纖維二糖及其水解產(chǎn)物葡萄糖都有還原性,并且兩者對(duì)還原糖的常用檢測(cè)方法——DNS法表現(xiàn)出不同的性質(zhì),36致使用DNS法檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程時(shí)會(huì)產(chǎn)生很大誤差,因此通常需要用帶有示差折光檢測(cè)器的HPLC法來(lái)定量檢測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行情況.而HPLC操作麻煩,檢測(cè)不便利,且靈敏度不高.如果能找到一種用紫外分光光度法即可測(cè)量反應(yīng)進(jìn)度的分析方法,則操作將十分便利,簡(jiǎn)單易行.基于以上考慮,本文首次提出了一種新的檢測(cè)纖維二糖水解的方便的分析方法:將纖維二糖的醛基部位用甲氧基來(lái)替代,即把纖維二糖制成甲基-β-D-纖維二糖苷,這種物質(zhì)由于沒(méi)有還原性,可以方便使用常規(guī)DNS法來(lái)測(cè)定反應(yīng)生成還原糖的量.同時(shí),甲基-β-D-纖維二糖苷作為纖維素很好的模型物也常被用作研究纖維素催化水解的底物.33,37

圖1 35 °C及pH 5.0時(shí)Nα-十二烷基-L-谷氨酸(L)水溶液的電導(dǎo)率-濃度關(guān)系圖Fig.1 Plot of electrical conductivity vs concentration for Nα-dodecyl-L-glutamic acid(L)at 35 °C and pH 5.0

纖維素酶的活性部位大都含有谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和組氨酸等殘基,38這些氨基酸殘基在催化纖維素降解的過(guò)程中對(duì)纖維素起到了重要的結(jié)合、傳遞質(zhì)子、誘導(dǎo)變形等多種作用和效應(yīng).39,40為了考察氨基酸對(duì)糖苷鍵水解斷裂的影響,本文選取了谷氨酸和組氨酸兩種氨基酸,通過(guò)它們與合成的功能表面活性劑L的復(fù)配構(gòu)成新的催化體系,并研究這些膠束體系的催化活性.同時(shí)為了檢驗(yàn)本文建立的DNS法的可靠性,我們將多個(gè)催化體系的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也同時(shí)用HPLC法進(jìn)行了對(duì)比檢測(cè),典型的HPLC圖譜如圖2所示,其還原糖的分析結(jié)果列于表1中.從圖2可以看到,反應(yīng)的主要產(chǎn)物為葡萄糖,以及少量的果糖,還有一種保留時(shí)間在17.53 min的未知產(chǎn)物.從表1中的數(shù)據(jù)我們可以看到兩種方法在誤差允許范圍內(nèi)較為一致,本文建立的分析方法是可信的.

圖2 膠束催化MCB水解10 h后的高效液相譜圖Fig.2 High performance liquid chromatography(HPLC)spectrum of solution of micelle-catalyzed MCB hydrolysis after 10 h

表1 DNS法所得還原糖產(chǎn)率和高效液相法所得葡萄糖產(chǎn)率及果糖產(chǎn)率的比較aTable 1 Comparison between the yield of reducing sugar detected by DNS method and the yield of glucose,the yield of fructose obtained by HPLC methoda

從表1中可以看出,谷氨酸或組氨酸對(duì)MCB水解的催化活性較小,膠束L對(duì)MCB的催化水解活性比兩種氨基酸大了近一倍.這主要是因?yàn)槟z束體系不僅含有羧基、氨基等功能基團(tuán)可以參與反應(yīng),同時(shí)它對(duì)有機(jī)底物具有增溶作用,更重要的是膠束還提供了特殊的類似于天然酶的微環(huán)境,這種微環(huán)境的極性、粘度、介電常數(shù)等性質(zhì)與水溶液有很大不同,可以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行.41,42膠束和氨基酸的復(fù)配體系(L+Glu和L+His)對(duì)MCB水解的催化活性要比單獨(dú)的膠束體系好,這主要是因?yàn)镚lu或His的加入增加了體系內(nèi)質(zhì)子給予體和親核試劑的數(shù)量,有利于水解反應(yīng)的進(jìn)行.L+Glu體系要比L+His體系的催化活性好,說(shuō)明谷氨酸中的羧酸基團(tuán)比組氨酸中的咪唑基團(tuán)在反應(yīng)中更有利于質(zhì)子與糖苷鍵上的氧結(jié)合,從而催化活性更大.

3.3 膠束催化MCB水解的動(dòng)力學(xué)

圖3顯示了表面活性劑L在5×10-5-2×10-3mol·L-1濃度范圍內(nèi)MCB水解反應(yīng)的表觀一級(jí)速率常數(shù)(kobsd)的變化情況.在實(shí)驗(yàn)條件下,初始反應(yīng)時(shí)間段內(nèi),反應(yīng)對(duì)反應(yīng)物MCB濃度是表觀一級(jí)的.從圖中可以看出在pH 5.0的條件下,表觀一級(jí)速率常數(shù)隨著表面活性劑濃度的增大而增大.

圖3 表面活性劑濃度對(duì)MCB水解表觀一級(jí)速率常數(shù)(kobsd)的影響Fig.3 Effects of the concentration of surfactant on the apparent first-order rate constants(kobsd)of MCB hydrolysis

根據(jù)膠束催化的相分離模型可知,43水解反應(yīng)能同時(shí)在膠束假相和水溶液本體相中進(jìn)行,如示意圖1所示,膠束(M)與底物(S)首先結(jié)合而形成復(fù)合物MS,然后復(fù)合物再反應(yīng)生成產(chǎn)物P.同時(shí)底物S在本體相中也自發(fā)水解生成產(chǎn)物P.方程(1)為膠束催化的動(dòng)力學(xué)方程式.44,45

其中,kw和km分別表示底物在水溶液和膠束相中的一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù),Ks為底物與膠束的結(jié)合常數(shù),N為膠束聚集數(shù),cD為表面活性劑總濃度,cmc為臨界膠束濃度.

由方程(1)可知,以 1/(kobsd-kw)對(duì)1/(cD-cmc)作圖應(yīng)該得到一直線,km和N/Ks的值可由直線的截距和斜率得到.其中,cmc為表面活性劑L的第一個(gè)臨界膠束濃度(2.07×10-5mol·L-1).如圖4所示,直線的線性關(guān)系很好(相關(guān)系數(shù)0.99),km和N/Ks的值分別為2.65×10-6s-1和1.31×10-5mol·L-1.一般情況下,膠束的聚集數(shù)N在30-100之間,則Ks估算為2.29×106-7.62×106L·mol-1.與純水溶液條件相比,km較大(km/kw=1.77×104),說(shuō)明此膠束體系確實(shí)能明顯促進(jìn)MCB水解的進(jìn)行.結(jié)合常數(shù)Ks值較大則說(shuō)明了MCB可以較好地增溶到膠束中并能與之很好地結(jié)合,從而加速了自身的水解反應(yīng).

示意圖1 膠束催化的動(dòng)力學(xué)模型Scheme 1 Kinetic model of micellar catalysis

圖 4 1/(kobsd-kw)對(duì)1/(cD-cmc)作圖Fig.4 plots of 1/(kobsd-kw)vs 1/(cD-cmc)

3.4 pH對(duì)膠束催化MCB水解的影響

溶液pH值對(duì)水解反應(yīng)有很大影響,通過(guò)考察pH對(duì)反應(yīng)的影響可以分析研究水解過(guò)程中催化活性物種的變化及其催化反應(yīng)的機(jī)理.由此我們研究了pH=2.0-11.0范圍內(nèi)功能膠束L催化MCB水解的反應(yīng),得到了pH對(duì)產(chǎn)物葡萄糖生成的影響情況,如圖5所示.從圖5中可以看到葡萄糖產(chǎn)率隨著pH的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),在pH=5.0時(shí),葡萄糖的產(chǎn)率最大,為9.02%.這樣的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與大多數(shù)纖維素酶的最佳催化活性在pH 4.0-6.5的pH效應(yīng)十分類似.實(shí)驗(yàn)測(cè)得膠束中谷氨酸殘基上兩個(gè)羧酸的電離情況與谷氨酸小分子在水溶液中的電離略有不同,其兩個(gè)羧酸的電離常數(shù)pKa1和pKa2分別為2.46和5.35.當(dāng)pH=5.0時(shí),膠束中谷氨酸殘基上的兩個(gè)羧酸一個(gè)處于解離的狀態(tài),另一個(gè)處于未解離的狀態(tài),這與天然酶的“雙酸作用”催化機(jī)理類似,可以認(rèn)為處于未解離狀態(tài)的羧酸上的氫原子容易與糖苷鍵上的氧原子形成氫鍵,同時(shí)已電離出氫質(zhì)子的羧酸根進(jìn)攻糖苷鍵附近的碳原子,從而催化了糖苷鍵的斷裂.

圖5 pH對(duì)膠束L催化MCB生成的葡萄糖產(chǎn)率的影響Fig.5 Effects of pH on yield of glucose for MCB hydrolysis catalyzed by micelle L

3.5 氨基酸對(duì)膠束催化MCB水解的影響

為了研究小分子氨基酸的加入對(duì)膠束L催化MCB水解的影響,我們考察了不同濃度的組氨酸和谷氨酸對(duì)葡萄糖產(chǎn)率的影響,如圖6所示.從圖6可以看出組氨酸和谷氨酸的濃度均在2×10-3mol·L-1時(shí),即cL:cHis(或cGlu)=1:1時(shí)還原糖產(chǎn)率最大,分別為11.8%和13.9%.這說(shuō)明小分子氨基酸與膠束的協(xié)同作用對(duì)MCB水解反應(yīng)有明顯的影響,只有在特定的官能團(tuán)比例下,體系中各基團(tuán)才能達(dá)到良好的協(xié)同效果.從圖6可以發(fā)現(xiàn),在膠束中加入谷氨酸比組氨酸對(duì)反應(yīng)更有利,這與單獨(dú)的谷氨酸和組氨酸對(duì)反應(yīng)的影響剛好相反(表1),這顯示了膠束微環(huán)境的特殊效果,也說(shuō)明羧酸基團(tuán)對(duì)糖苷鍵的水解斷裂所起的作用強(qiáng)于咪唑基團(tuán),與許多文獻(xiàn)46-49報(bào)到的纖維素酶的作用主要是“雙羧酸催化機(jī)理”相符合.

3.6 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和活化能的計(jì)算

由于纖維素水解的活化能很大,因此溫度對(duì)纖維素中糖苷鍵的斷裂有很大的影響.在以前的文獻(xiàn)報(bào)道中,除了酸催化外,纖維素的水解通常很慢,必須在較高的溫度下(一般大于150°C)水解反應(yīng)才較為明顯,但高溫水解往往也會(huì)同時(shí)生成大量復(fù)雜的副產(chǎn)物.50,51在本文的工作中,我們力求水解反應(yīng)在較低溫(≤130°C)下進(jìn)行,這樣水解產(chǎn)物相對(duì)單一,基本上為葡萄糖.需要說(shuō)明的是,與天然纖維素水解酶作用機(jī)理類似,本文的MCB催化水解反應(yīng)也被發(fā)現(xiàn)是一個(gè)連續(xù)反應(yīng)的過(guò)程:首先MCB糖苷鍵斷裂并被水解為氨基酸葡萄糖酯和甲基葡萄糖苷,隨后氨基酸葡萄糖酯再水解為葡萄糖和氨基酸(圖S1和S2,見(jiàn)補(bǔ)充材料).然而所不同的是,我們的催化體系在弱酸性條件(pH 5.0)下對(duì)第一步糖苷鍵的斷裂效果較好,而對(duì)第二步酯水解過(guò)程效果不明顯,需要在堿性條件下來(lái)進(jìn)行氨基酸葡萄糖酯的水解.另外,正如前文指出的,我們也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物除了有葡萄糖外,還有少量的未知產(chǎn)物(HPLC上保留時(shí)間在17.53 min位置),根據(jù)對(duì)照,它不是脫水葡萄糖,5-羥甲基糠醛,乙酰丙酮,乙酰丙酸,甲酸,乙酸,糠醛,甲基葡萄糖苷等物質(zhì),其產(chǎn)物還需要進(jìn)一步分析.

圖6 氨基酸濃度對(duì)葡萄糖產(chǎn)率的影響Fig.6 Effects of the concentration of amino acids on yield of glucose

圖7(a)顯示了L+Glu體系在90-130°C溫度下催化MCB水解在0-50 h內(nèi)的葡萄糖產(chǎn)率的變化情況.從圖7(a)中可以看出,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,葡萄糖的產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì),葡萄糖產(chǎn)率的極大值出現(xiàn)在20 h附近.在不同的溫度(90、100、110、120和130°C)下,葡萄糖產(chǎn)率的極大值分別為15.0%、19.5%、26.1%、35.1%和44.3%.在不同的溫度下,葡萄糖產(chǎn)率隨時(shí)間的變化也不相同,當(dāng)溫度高于100°C時(shí),反應(yīng)溫度越高,葡萄糖產(chǎn)率先高后低的趨勢(shì)越明顯,這主要是因?yàn)樵谳^高溫度下,葡萄糖又會(huì)較緩慢地降解為甲酸、乙酸、乙酰丙酸等物質(zhì).

圖7 L+Glu在不同溫度下催化MCB水解的葡萄糖產(chǎn)率隨時(shí)間的變化圖(a)和不同溫度下-ln(1-ct/c0)對(duì)反應(yīng)時(shí)間t作圖(b)Fig.7 Plots of yield of glucose vs reaction time for MCB hydrolysis catalyzed by L+Glu at the different temperatures(a)and plots of-ln(1-ct/c0)vs reaction time at the different temperatures(b)

圖8 L+Glu催化MCB水解的表觀一級(jí)速率常數(shù)(kobsd)的對(duì)數(shù)與溫度(T)的關(guān)系圖Fig.8 Plot of the logarithm of apparent first rate constant(kobsd)vs temperature(T)for the hydrolysis of MCB catalyzed by L+Glu

為了避免這種現(xiàn)象的干擾,我們采用初始反應(yīng)階段的數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)算葡萄糖的反應(yīng)速率常數(shù).圖7(b)所示為初始時(shí)間段內(nèi),-ln(1-ct/c0)vs t的關(guān)系圖,其中c0是反應(yīng)物MCB的初始濃度,ct是葡萄糖在t時(shí)刻的濃度.可以看到,-ln(1-ct/c0)vs t作圖均呈現(xiàn)出良好的直線關(guān)系,其相關(guān)系數(shù)都大于0.99,說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)條件下,初始反應(yīng)時(shí)間段內(nèi),反應(yīng)對(duì)反應(yīng)物MCB濃度是表觀一級(jí)的.由圖7(b)的直線斜率可計(jì)算得到在90、100、110、120和130 °C溫度下L+Glu催化MCB水解的表觀一級(jí)速率常數(shù)kobsd分別為3.70×10-6、8.33×10-6、1.90×10-5、4.64×10-5和8.51×10-5s-1.

根據(jù)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論中的Arrhenius公式,以lnkobsd對(duì)1/T作圖應(yīng)得到一條直線,利用直線的斜率和截距則可求出反應(yīng)活化能Ea和指前因子A的值.如圖8所示,直線的相關(guān)系數(shù)大于0.98,說(shuō)明此催化反應(yīng)在此溫度范圍內(nèi)較好地符合Arrhenius公式,這樣計(jì)算出葡萄糖生成的活化能為97.18 kJ·mol-1,指前因子為3.51×108.文獻(xiàn)52,53報(bào)道纖維素水解生成葡萄糖的活化能一般在110-180 kJ·mol-1之間,由此看出膠束催化體系能夠大幅度地降低MCB水解的活化能,在較低溫下能較容易地催化MCB水解生成葡萄糖.

4 結(jié)論

本文提出了一種新的檢測(cè)纖維二糖水解的方便的分析方法.制備了一種長(zhǎng)鏈谷氨酸表面活性劑,并研究了它所形成的膠束體系對(duì)MCB水解的催化作用.研究結(jié)果表明,膠束L能夠有效地催化MCB的水解,其“鐘形”pH效應(yīng)說(shuō)明此功能膠束體系有著類似天然纖維素水解酶“雙酸作用”的催化機(jī)理.小分子氨基酸Glu和His的添加能夠更好地促進(jìn)膠束對(duì)MCB的催化水解.溫度對(duì)此水解反應(yīng)的速率和副產(chǎn)物生成有重要影響.計(jì)算了葡萄糖生成的初始反應(yīng)速率常數(shù),并計(jì)算得到反應(yīng)活化能為97.18 kJ·mol-1,表明該催化體系在較低溫下能較容易地催化MCB水解生成葡萄糖.本文的研究對(duì)理解纖維素降解酶的作用機(jī)理以及對(duì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供了基礎(chǔ)研究信息.

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