純化工藝對乙肝寧復(fù)方中氨基酸影響

李仲秋， 鄒 龍， 劉 輝， 李歡歡， 夏新華

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙410208)

在中藥制劑制備工藝研究中，如何有效去除非藥用部分，充分保留有效成分、同時降低制劑的吸濕性一直是研究的重要內(nèi)容。醇沉法是運(yùn)用較廣泛的傳統(tǒng)精制純化方法。近年來，一些新材料、新技術(shù)已運(yùn)用于中藥水提液的純化中，其中絮凝澄清法應(yīng)用較多，該法在保留有效成分、降低吸濕性等方面優(yōu)于傳統(tǒng)醇沉法［1-3］，尤其對麻黃堿、芍藥苷、綠原酸、黃酮、多糖等成分較醇沉法具有更高保留率［4］。

關(guān)于殼聚糖絮凝澄清法和醇沉工藝優(yōu)劣比較的研究較多［5-6］，但尚未見有關(guān)兩者對中藥中游離氨基酸量影響的報道。乙肝寧復(fù)方是由黃芪、茵陳、白芍等十三味中藥組成的治療慢性遷延性肝炎的臨床有效驗方，具有健脾化濕、滋腎養(yǎng)肝、活血化瘀等作用。黃芪系方中君藥，對于黃芪甲苷、芍藥苷、川楝素等有效成分的測定方法已有相關(guān)報道［7-9］，而對無效成分氨基酸未見相關(guān)研究。本課題以乙肝寧復(fù)方為模型藥物，早期研究表明:殼聚糖絮凝澄清法較醇沉法可更好降低乙肝寧浸膏的吸濕性［3］。本實驗旨在研究從乙肝寧復(fù)方水提液中分離得到的氨基酸的吸濕性強(qiáng)弱，以及上述兩種工藝純化乙肝寧復(fù)方水提液后3種氨基酸量變化，闡述在絮凝澄清法降低中藥浸膏吸濕性中氨基酸的作用，為殼聚糖絮凝澄清工藝用于中藥水提液的精制純化提供依據(jù)。

1 儀器、材料和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀，配置G1329A自動控溫進(jìn)樣器、Agilent 1200可調(diào)波長紫外檢測器、HT-230A柱溫箱、Agilent 1200工作站(Agilent公司);AR1140電子分析天平 (奧豪斯國際貿(mào)易有限公司);TD5A-WS臺式低速離心機(jī)(湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司);PHS-25實驗室pH計 (上海理達(dá)儀器廠);DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (鞏義予華儀器有限責(zé)任公司);XW-80A微型旋渦混合儀 (上海滬西分析儀器廠有限公司)。

1.2 材料和試藥 乙肝寧各味藥材均購自安徽惠隆中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2010年版一部規(guī)定;茚三酮 (上海山浦化工有限公司);氨水 (重慶川東化工有限公司);732號陽離子交換樹脂 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);活性炭 (天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);精氨酸、脯氨酸、賴氨酸 (Br，Amresco公司);異硫氰酸苯酯 (PITC)(上海金山亭新化工試);三乙胺 (湖南匯虹試劑有限公司);冰醋酸 (汕頭市西隴化工有限公司);乙酸鈉 (西安化學(xué)試劑廠);乙腈 (色譜純);水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 乙肝寧復(fù)方總游離氨基酸的吸濕性考察

2.1.1 乙肝寧水提液的制備 參照2010版《中國藥典》 “乙肝寧顆粒”處方比例稱取214 g生藥(除黃芪)［10］，加10倍量水浸泡30 min，回流提取2 h，過濾，濾渣加8倍量水回流提取2 h，過濾，合并濾液，濃縮，備用。

2.1.2 總游離氨基酸的分離純化 將上述乙肝寧復(fù)方水提液濃縮至一定體積，調(diào)pH值至2.50，上732號陽離子交換樹脂柱，直至茚三酮反應(yīng)為陰性，靜置吸附2 h。蒸餾水洗滌，直至糖檢測 (α-萘酚濃硫酸Molish反應(yīng))為陰性，pH值為中性。2%氨水溶液洗脫，收集茚三酮反應(yīng)為陽性部分的洗脫液，減壓濃縮，上顆?；钚蕴恐揭欢〞r間后，用蒸餾水洗脫，收集茚三酮反應(yīng)為陽性反應(yīng)的洗脫液，濃縮，真空干燥，即得。

2.1.3 吸濕百分率的測定 配制氯化鈉過飽和溶液，置于玻璃干燥器中，放入25℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24 h，使其相對濕度達(dá)75%。取經(jīng)上述方法分離純化后的氨基酸分離物干浸膏和未經(jīng)任何處理的原浸膏供試品適量，研細(xì)，分別置P2O5干燥器內(nèi)干至恒定質(zhì)量。精密稱定已恒定質(zhì)量的稱量瓶，并放入厚約2 mm的供試品粉末，精密稱定后置于上述玻璃干燥器內(nèi)，25℃保存，定時稱量，計算吸濕百分率，以吸濕百分率 (%)為縱坐標(biāo)，時間(h)為橫坐標(biāo)作圖。結(jié)果表明，氨基酸分離物吸濕性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于乙肝寧復(fù)方原浸膏，具有較強(qiáng)吸濕性(見圖1)，可能對乙肝寧浸膏吸濕性有影響。

圖1 乙肝寧復(fù)方總游離氨基酸及原浸膏吸濕曲線Fig.1 Moisture absorption curves of total free-amino acids in Yiganning compound prescription and untreated Yiganning aqueous extract

2.2 兩種純化方法對乙肝寧復(fù)方水提液中3種吸濕性氨基酸影響的考察

2.2.1 乙肝寧水提液的制備及其純化處理

(1)乙肝寧水提液的制備 按2.1.1項下方法制備乙肝寧復(fù)方水提液，濃縮至1∶1.5(生藥-藥液)，備用。

(2)乙肝寧水提液的醇沉處理 取上述乙肝寧水提濃縮液250 mL，稀釋至1∶2，加乙醇使含醇量為70%，4℃靜置過夜，抽濾，濃縮至100 mL，備用。

(3)乙肝寧水提液的絮凝澄清處理 取上述乙肝寧水提濃縮液250 mL，稀釋至1∶6，調(diào)pH值至6.00，恒溫至60℃，1300 r/min攪拌速度下緩慢加入1%殼聚糖溶液250 mL，繼續(xù)攪拌10 min，靜置過夜，離心并抽濾，濃縮至100 mL，備用。

2.2.2 乙肝寧水提液及其純化樣品液中2種氨基酸的測定

色譜條件 HypersilBDSC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相 A為乙腈-水(4∶1)，流動相B為0.1 mol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH6.5)-乙腈 (97∶3)，梯度洗脫 (見表1);檢測波長為254 nm;體積流量為1 mL/min;柱溫32 ℃;進(jìn)樣量5 μL。

氨基酸混合對照品溶液的制備 取精氨酸(Arg)、脯氨酸 (Pro)、賴氨酸 (Lys)各約0.1 g，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，重蒸水稀釋至刻度，搖勻，備用。精密量取上述精氨酸對照品溶液與脯氨酸對照品溶液各0.7mL、賴氨酸對照品溶液1 mL，置于25 mL量瓶中，重蒸水稀釋至刻度，搖勻，即得。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

樣品溶液的預(yù)處理 取上述經(jīng)兩種純化方法處理的乙肝寧樣品溶液，各調(diào)pH值至2.50，分別上732號陽離子交換柱，靜態(tài)吸附2 h，蒸餾水洗滌至無糖 (α-萘酚濃硫酸Molish反應(yīng)為陰性)，2%氨水洗脫，收集茚三酮反應(yīng)為陽性部分，濃縮，真空干燥至恒定質(zhì)量，研細(xì)，備用。另取250 mL乙肝寧水提液，濃縮至100 mL，同法進(jìn)行預(yù)處理。

柱前衍生化供試品溶液的制備 精密稱取上述預(yù)處理所得不同干膏粉各適量，分別置于10 mL量瓶中，重蒸水稀釋至刻度，搖勻。精密量取1.4 mL，置于5 mL量瓶中，重蒸水稀釋至刻度，搖勻。精密量取稀釋后溶液2 mL，置于10 mL PEG管中，加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液和0.1 mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液各1 mL，渦旋1 min，暗反應(yīng)1 h，加入4 mL正己烷萃取，渦漩1 min，靜置10 min，吸取下層溶液，過濾，即得。

柱前衍生化的對照品溶液與空白對照液的制備精密量取氨基酸混合對照品溶液適量，置于5 mL量瓶中，重蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密量取稀釋液2 mL，照上述“柱前衍生化供試品溶液的制備”方法進(jìn)行處理，作為對照品溶液。另精密量取重蒸餾水2 mL，同法進(jìn)行處理，作為空白對照液。

系統(tǒng)適用性試驗 精密量取經(jīng)衍生化反應(yīng)后的混合對照品溶液、乙肝寧水提液供試品溶液及空白對照溶液各5 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明，3種氨基酸色譜峰分離良好，且空白對照未見干擾 (見圖2)。

線性關(guān)系考察 分別精密量取氨基酸混合對照品溶液5、4、2、1、0.5、0.25 mL于5 mL量瓶中，按上述“柱前衍生化供試品溶液的制備”方法進(jìn)行處理，每次進(jìn)樣5 μL，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

圖2 精氨酸、脯氨酸、賴氨酸的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of Arg，Pro，Lys

表2 3種氨基酸的線性關(guān)系Tab.2 Linear relationgship of three kinds of amino acids

精密度試驗 精密吸取同一柱前衍生化供試品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果Arg、Pro、Lys峰面積的RSD分別為0.68%、1.06%、2.50%。

穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一柱前衍生化供試品溶液 5 μL，分別于 0、2.5、5、10、15、24 h進(jìn)樣，測定峰面積，計算 Arg、Pro、Lys峰面積的RSD分別為2.65%、1.92%、2.88%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

重復(fù)性試驗 取上述乙肝寧水提液預(yù)處理所得干膏粉約0.08 g，共6份，精密稱定，依法測定3種氨基酸的量，計算Arg、Pro、Lys的RSD分別為2.87%、3.00%、2.68%。

加樣回收試驗 取已知含量的乙肝寧復(fù)方水提液預(yù)處理所得干膏粉適量，共6份，精密稱定，分別精密加入精氨酸對照品溶液 (0.3546 mg/mL)1 mL，脯氨酸對照品溶液 (5.236 μg/mL)，賴氨酸對照品溶液 (0.03535 mg/mL)各0.5 mL，定容至5 mL，按上述“柱前衍生化供試品溶液的制備”方法進(jìn)行處理，依法測定，計算回收率，結(jié)果Arg、Pro、Lys的平均回收率分別為96.93%、97.99%、106.01%，RSD分別為1.79%、1.86%、2.52%。

樣品的測定 取乙肝寧水提液及其兩種純化溶液經(jīng)預(yù)處理后所得干膏粉適量，依法測定其精氨酸、脯氨酸、賴氨酸的量，并計算純化過程3種氨基酸的保留率，結(jié)果見表3～4。

表3 不同干膏樣品中3種氨基酸測定 (n=4，±s)Tab.3 Content of three kinds of amino acids in different dry extract samples(n=4，±s)

表3 不同干膏樣品中3種氨基酸測定 (n=4，±s)Tab.3 Content of three kinds of amino acids in different dry extract samples(n=4，±s)

)干膏樣品來源 氨基酸/(mg·g－1精氨酸 脯氨酸 賴氨酸乙肝寧水提液59.2±3.2 0.438±0.033 2.98±0.20醇沉純化液 11.9±0.7 0.793±0.010 1.08±0.04絮凝澄清純化液63.2±0.2 0.442±0.006 3.49±0.22

表4 不同藥液樣品中3種氨基酸量及其保留率Tab.4 Content and retention rates of three kinds of amino acids in different liquid medicine samples

3 小結(jié)和討論

目前，測定中藥材中氨基酸的方法主要有氨基酸自動分析儀測定法、蒸發(fā)光散射-高效液相色譜法 (ELSD-HPLC)、柱前衍生高效液相法等［11］。氨基酸自動分析儀、ELSD-HPLC均具有操作簡單、分析時間短等優(yōu)點，但前者價格昂貴，而后者靈敏度低，作者在預(yù)實驗中曾嘗試此法，較難測定樣品中游離氨基酸的量，故選用靈敏度高的柱前衍生高效液相法。PITC柱前衍生法采用常規(guī)C18柱、UV檢測器就可檢測一、二級氨基酸，且產(chǎn)物穩(wěn)定，因而本實驗選用PITC作為衍生化試劑。

在色譜條件摸索中，對柱溫和進(jìn)樣量進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者對分離效果影響較大。當(dāng)柱溫過高或過低時，分離度均會降低，這可能是氨基酸性質(zhì)相似，在一定溫度范圍內(nèi)，它們洗脫速度接近，難分開;當(dāng)進(jìn)樣量10 μL時，精氨酸、賴氨酸前沿峰顯著，改為5 μL后，峰形得到顯著改善，分析原因可能是進(jìn)樣溶液中含有約50%的乙腈，與初始流動相溶劑體系存在較大差距，進(jìn)樣體積越大影響越大，引起前沿峰。

20種常見氨基酸中只有精氨酸、脯氨酸、賴氨酸有吸濕性，且后兩者吸濕性強(qiáng)于糖類。因此，本實驗以上述3種氨基酸為指標(biāo)，比較了兩種純化方法對乙肝寧復(fù)方水提液中氨基酸的影響。結(jié)果表明，殼聚糖絮凝澄清法對乙肝寧復(fù)方水提液中精氨酸、賴氨酸的保留明顯優(yōu)于醇沉法;而對于脯氨酸的保留，雖不如醇沉法，但仍有較高的保留率。此現(xiàn)象可能是由于精氨酸和賴氨酸的水溶性強(qiáng) (極性大)、醇溶性小，而脯氨酸屬一種非極性氨基酸，具有相對大的醇溶性所致。這與前期研究結(jié)果(殼聚糖絮凝澄清法對中藥水提液中極性大的水溶性成分的保留優(yōu)于醇沉法，而對低極性的親脂性成分的保留則不如醇沉法)一致［3］。另外，由于3種氨基酸pKa較高，在弱酸性的中藥水提液中大部分以陽離子形式存在，而根據(jù)殼聚糖絮凝澄清法原理［12］，殼聚糖本身帶有正電荷，同性相斥，故殼聚糖絮凝澄清法對水提液中的氨基酸的保留總體較高。據(jù)此，可認(rèn)為殼聚糖絮凝澄清法相對于醇沉法可降低中藥浸膏的吸濕性，不是通過影響氨基酸量的途徑來實現(xiàn)的。李靜對乙肝寧復(fù)方中糖類吸濕性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)糖類是影響乙肝寧吸濕性的重要因素之一，說明吸濕性降低機(jī)制可能與保留吸濕性弱的多糖相關(guān)［13］。

［1］侯向明，王桂英.吸附澄清劑在中藥制劑中的應(yīng)用［J］.天津藥學(xué)，2005，17(2):67-69.

［2］英錫相，田福珍，李紹維，等.心安膠囊工藝改進(jìn)及山楂葉總黃酮含量的測定［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2001，28(2):113.

［3］楚笑輝，唐路梅，夏新華.殼聚糖絮凝澄清工藝與醇沉工藝純化乙肝寧復(fù)方水提液的對比［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(21):1-4.

［4］李鋒濤，潘金火.絮凝劑在中藥制劑中的應(yīng)用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17(4):647-649.

［5］金 巖，張 字.殼聚糖用于五苓滴丸澄清工藝的考察［J］.實用藥物與臨床，2010，13(3):341-343.

［6］孫運(yùn)從，林桂濤.殼聚糖絮凝沉降法與乙醇沉淀法對炙甘草湯的純化效果的比較［J］.中成藥，2011，33(1):173-175.

［7］曹湘萍，梁建寧，何曉艷，等.HPLC—ELSD法測定乙肝寧顆粒中黃芪甲苷含量［J］.中成藥，2005，27(2):165-167.

［8］李 丹，姜家書，付 彬.高效液相色譜法測定乙肝寧顆粒中芍藥苷含量［J］.河南中醫(yī)，2010，30(5):450-451.

［9］張秋蓉，周 濃，楊 敏.HPLC測定乙肝寧顆粒中川楝素［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16(10):78-79.

［10］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:403-404.

［11］賈 薇，陳 濤.中藥中氨基酸含量測定的研究概況［J］.天津藥學(xué)，2009，21(5):50-52.

［12］朱興年.殼聚糖在中藥提取液中的應(yīng)用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2002，13(9):557.

［13］李 靜.殼聚糖絮凝澄清對乙肝寧中糖類及其吸濕性的影響研究［D］.長沙:湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2012:40.