二次蒸餾-萃取耦合法提取頸復(fù)康制劑揮發(fā)油的研究

王春民， 楊冬麗*， 鄭艷春， 張瑞華

(頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心，河北承德067000)

頸復(fù)康制劑揮發(fā)油的提取方法是將含有揮發(fā)油的藥材川芎、蒼術(shù)、羌活、乳香、沒藥按處方比例混合后用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。其中川芎揮發(fā)油中所含川芎內(nèi)酯類化合物對(duì)微血管具有解痙、增加毛細(xì)血管開放數(shù)目、加快血流速度的作用［1-2］。Z-藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯A是川芎內(nèi)酯類化合物中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的2種成分［3］，對(duì)發(fā)揮頸復(fù)康制劑活血通絡(luò)的功效起到了重要作用。研究表明川芎與其它藥材混合不利于Z-藁本內(nèi)酯的提取，且隨著混合藥材種類的增加，藁本內(nèi)酯提取率下降［4］。為此，開展對(duì)頸復(fù)康制劑揮發(fā)油的提取工藝研究，提高川芎內(nèi)酯類的轉(zhuǎn)移率，較大限度的保留有效成分，提高藥品療效。本研究分別以Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素為指標(biāo)考察二次蒸餾-萃取耦合法和傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法兩種提取方法對(duì)頸復(fù)康制劑揮發(fā)油提取效率的影響。

1 儀器與試藥

Agilent7890A氣相色譜儀，Agilent G4513A自動(dòng)進(jìn)樣器，HP-530 m×0.32 mm石英毛細(xì)管柱 (Agilent公司)，蒼術(shù)素對(duì)照品 (中國食品藥品檢定研究院，111924-201102)，Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A對(duì)照品 (上海順勃生物工程有限公司，純度≥98%)，無水乙醇 (天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)。川芎 (chuanxiong rhizoma，批號(hào) 100102)、蒼術(shù) (atractylodis rhizoma，批號(hào)100401)、羌 活 (NotopterygiiRhizoma etradix，批 號(hào)100504)、乳香 (Bosewlliacarte，批 號(hào) 100301)、沒 藥(commiphora(Nees)Engl，批號(hào)100101)均由頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，經(jīng)王春民主任中藥師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法

2.1.1 揮發(fā)油中Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素的測定方法在文獻(xiàn)［5］研究基礎(chǔ)上，將測定方法確定為:采用HP-530 m×0.32 mm石英毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度250℃，脈沖不分流，程序升溫，初始溫度110℃，以1.5℃/min升溫至155℃，再以20℃/min升溫至250℃，保持3 min。載氣氮?dú)猓M(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素對(duì)照品適量，用無水乙醇配成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.2、0.4 mg/mL的溶液，分別精密吸取Z-藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL;洋川芎內(nèi)酯A對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mL;蒼術(shù)素對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.3，0.5，0.8，1 mL置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件進(jìn)樣檢測。分別以Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程分別為 Z-藁本內(nèi)酯 Y=1047.3 X－6.326，r=0.9996;洋川芎內(nèi)酯 A Y=1058.7 X－1.4251，r=0.9999;蒼術(shù)素Y=1011.3X－1.8131，r=0.9997線性范圍分別為 11.24 ～112.4 μg/mL;1.638 ～16.38 μg/mL;4.172 ～41.72 μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密吸取頸復(fù)康制劑揮發(fā)油1 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取0.1 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，即得。

2.1.4 對(duì)照品溶液的制備 取Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素對(duì)照品適量，精密稱定，用無水乙醇分別配成質(zhì)量濃度為25、5、16 μg/mL的溶液。見圖1。

圖1 對(duì)照品A和樣品B揮發(fā)油GC圖譜

2.1.5 儀器精密度 取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算 RSD分別為1.03%、1.11%、0.86%(n=6)，精密度符合要求。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次提得的揮發(fā)油，按供試品溶液的制備方法，重復(fù)處理6份，測定，計(jì)算含量，RSD分別為1.22%、1.41%、1.37%(n=6)，重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h測定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD分別為1.08%、1.19%、0.97%。試驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的揮發(fā)油0.5 mL，置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取0.1 mL，至10 mL量瓶中，精密加入適量Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，在上述色譜條件下，進(jìn)樣測定，計(jì)算平均回收率分別為99.6%、101.4%、100.5%，RSD分別為1.46%、1.37%、1.82%，(n=6)。

2.2 頸復(fù)康制劑揮發(fā)油的提取工藝研究

2.2.1 傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法 按處方比例取蒼術(shù)、川芎、羌活、乳香、沒藥，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，提取6 h，GC法檢測揮發(fā)油中Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表2。

2.2.2 二次蒸餾-萃取耦合法提取頸復(fù)康制劑揮發(fā)油 按處方比例取除川芎外的其余四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，得揮發(fā)油Ⅰ，備用;另取川芎藥材加6倍量水，并于揮發(fā)油提取器中加入一定量揮發(fā)油Ⅰ，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油，得揮發(fā)油II，合并揮發(fā)油Ⅰ和揮發(fā)油Ⅱ，GC法檢測。

2.2.2.1 考察不同揮發(fā)油提取時(shí)間對(duì)Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A轉(zhuǎn)移率的影響 按處方比例取蒼術(shù)、羌活、乳香、沒藥四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取四味藥材揮發(fā)油，備用;另取川芎藥材加6倍量水，于揮發(fā)油提取器中加入0.2 mL四味藥材揮發(fā)油后，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油，提取時(shí)間分別為4 h、6 h、8 h。分別合并提得的川芎揮發(fā)油和四味藥材揮發(fā)油后，混勻，GC法檢測，計(jì)算揮發(fā)油中Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)移率，考察不同提取時(shí)間對(duì)Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A轉(zhuǎn)移率的影響。結(jié)果見表1。

表1 提取時(shí)間對(duì)Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A轉(zhuǎn)移率的影響

研究表明，提取時(shí)間在4～6 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A轉(zhuǎn)移率呈逐漸增加的趨勢;當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到8 h后，Z-藁本內(nèi)酯的轉(zhuǎn)移率不再有明顯增加，而洋川芎內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)移率稍低于提取6 h的結(jié)果。因此，將提取時(shí)間確定為提取6 h。

2.2.2.2 不同揮發(fā)油萃取量對(duì)Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素轉(zhuǎn)移率的影響 按處方比例取蒼術(shù)、羌活、乳香、沒藥四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，備用;另取川芎藥材加6倍量水，分別于揮發(fā)油提取器中加入0.1、0.2、0.3 mL已提得的四味藥材揮發(fā)油后，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油。合并提得的川芎揮發(fā)油和四味藥材揮發(fā)油后，混勻，GC法檢測，計(jì)算混合后揮發(fā)油中Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素的轉(zhuǎn)移率，考察四味藥材揮發(fā)油的加入量對(duì)Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素轉(zhuǎn)移率的影響。結(jié)果見表2。

2.2.2.3 二次蒸餾-萃取耦合法提取工藝的確定 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，四味藥材揮發(fā)油的加入量對(duì)Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素轉(zhuǎn)移率的影響較小，因此，考慮到實(shí)驗(yàn)的可操作性和準(zhǔn)確性，將四味藥材揮發(fā)油的加入量確定為0.2 mL。確定提取工藝為:按處方比例取蒼術(shù)、羌活、乳香、沒藥四味藥材，加6倍量水，用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油6 h，備用。另取川芎藥材加6倍量水，于揮發(fā)油提取器中加入0.2 mL四味藥材揮發(fā)油后，用水蒸氣蒸餾法提取川芎揮發(fā)油6 h，合并提得的川芎揮發(fā)油和四味藥材揮發(fā)油，混勻。GC法檢測混合后揮發(fā)油中Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素的轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表2。

表2 不同提取方法中Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素轉(zhuǎn)移率

由表中數(shù)據(jù)可以看出，四味藥材揮發(fā)油的加入量對(duì)Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、蒼術(shù)素轉(zhuǎn)移率的影響較小。

與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比，二次蒸餾-萃取耦合法提得的頸復(fù)康制劑揮發(fā)油，Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)移率與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比提高了約3倍，而對(duì)蒼術(shù)素的轉(zhuǎn)移率沒有明顯影響。

為進(jìn)一步確定上述揮發(fā)油提取工藝的合理性，分別用兩種方法提得的頸復(fù)康制劑揮發(fā)油展開對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛與活血作用的藥理學(xué)研究，結(jié)果顯示經(jīng)二次蒸餾-萃取耦合法提得的頸復(fù)康制劑揮發(fā)油與水蒸氣蒸餾法提得的揮發(fā)油相比鎮(zhèn)痛與活血作用增強(qiáng)，具體內(nèi)容將另文發(fā)表。

3 討論

研究表明采用二次蒸餾-萃取耦合法提取的頸復(fù)康制劑揮發(fā)油中Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)移率與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法相比提高了約3倍，而對(duì)蒼術(shù)素的轉(zhuǎn)移率沒有明顯影響。進(jìn)一步證明川芎與其它藥材混合不利于內(nèi)酯類成分的提取。

不同揮發(fā)油加入量對(duì)Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A轉(zhuǎn)移率無顯著影響，考慮到用于萃取的揮發(fā)油加入量太少會(huì)產(chǎn)生黏壁現(xiàn)象，因此，在進(jìn)行研究時(shí)，加入0.2 mL。

本研究曾采用水蒸氣蒸餾法單獨(dú)對(duì)川芎藥材進(jìn)行揮發(fā)油提取，隨著提取時(shí)間的延長，在提取過程中容易出現(xiàn)揮發(fā)油上下分層的現(xiàn)象，下層揮發(fā)油會(huì)逐漸隨著冷凝水流回至提取容器中，導(dǎo)致提取率大大降低，采用二次蒸餾-萃取耦合法提取時(shí)避免了分層現(xiàn)象的出現(xiàn)。分析原因可能是由于相似相溶的原理，使川芎揮發(fā)油分子更易聚集于極性相似的揮發(fā)油分子中而遠(yuǎn)離極性較強(qiáng)的水中。

采用二次蒸餾-萃取耦合法提取頸復(fù)康制劑中的揮發(fā)油避免了單獨(dú)提取川芎揮發(fā)油時(shí)容易分層的現(xiàn)象，提高了Z-藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A的轉(zhuǎn)移率的同時(shí)保持了其它揮發(fā)油成分轉(zhuǎn)移率。采用頸復(fù)康制劑的其它四味藥材揮發(fā)油作為萃取溶劑，最大限度的保留了有效成分的同時(shí)，避免了其它溶劑與成分的引入，該方法用于頸復(fù)康制劑中揮發(fā)油的提取更為合理。中藥揮發(fā)油成分復(fù)雜，尤其是多種藥材揮發(fā)油混合提取時(shí)，不同成分存在相互影響，因此提取工藝的確定值得研究。

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