石蒜屬植物SCoT-PCR 反應(yīng)體系構(gòu)建及優(yōu)化

姜小鳳， 高燕會， 童再康， 黃春紅

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 浙江 臨安311300）

石蒜屬Lycoris 植物具有極大觀賞價值和藥用價值。 全世界石蒜屬植物共有20 多種， 主要分布于亞洲， 而中國是石蒜屬植物的分布中心， 資源優(yōu)勢明顯， 有16 種1 變種， 占全屬的75%， 其中12 種為中國特有， 主要分布于江蘇、 浙江、 安徽等地［1］。 對石蒜屬植物的研究主要集中在分類學(xué)、 細(xì)胞遺傳學(xué)、育種學(xué)、 分子生物學(xué)、 藥用及藥理幾個方面。 近年來， 石蒜屬植物在分子生物學(xué)方面的研究較多， 鄧傳良等［2－4］利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA, RAPD）對長筒石蒜Lycoris longituba 3 個居群的遺傳多樣性及分化程度進(jìn)行了研究， 表明長筒石蒜種內(nèi)具有較高的遺傳多樣性［2－4］。袁菊紅等［5］用簡單序列重復(fù)區(qū)間（inter-simple sequence repeat, ISSR）和RAPD 標(biāo)記分別對不同采集地的37 份石蒜屬植物的遺傳多樣性進(jìn)行檢測。 時劍等［6］構(gòu)建并優(yōu)化了中國石蒜的微衛(wèi)星DNA（simple sequence repeat, SSR） 體系， 但這些標(biāo)記在石蒜屬植物的研究中存在一些不足， 如RAPD 標(biāo)記的影響因素較多，穩(wěn)定性和重復(fù)性差； 隨機(jī)擴(kuò)增長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）標(biāo)記對DNA 純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高且費(fèi)用昂貴； SSR 標(biāo)記雖為共顯性標(biāo)記， 但其引物的開發(fā)和設(shè)計(jì)耗時費(fèi)力。因此， 為了更好地對石蒜屬植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定進(jìn)行深入研究， 我們采用Collard 等［7］和Mackill［8］在水稻Oryza sativa 上基于單引物擴(kuò)增反應(yīng)（single primer amplification reaction, SPAR）提出的一種新型目的基因分子標(biāo)記——目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（start condon tardeted polymorphism, SCoT）分子標(biāo)記， 該標(biāo)記具有操作簡單、 多態(tài)性高﹑重復(fù)性好﹑引物通用性高、 可獲得豐富的遺傳信息且能跟蹤性狀等優(yōu)點(diǎn)， 有效補(bǔ)充了ISSR 標(biāo)記和RAPD 標(biāo)記的不足［9］。 目前， SCoT 標(biāo)記已成功應(yīng)用于光稃稻Oryza glaberrima［7］， 花生Arachis hypogaea［10］， 甜橙Citrus sinensis［11］， 柑 橘Citrus reticulata， 龍眼Dimocarpus longana［12－13］， 甘蔗Saccharum officenarum［14］等的種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析， 但在石蒜屬植物上遺傳多樣性以及種質(zhì)鑒定等方面未見報道。 為此， 本研究以石蒜屬植物為材料， 建立并優(yōu)化石蒜屬植物SCoTPCR 反應(yīng)體系， 旨在為石蒜屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析及遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的石蒜屬植物種植于浙江農(nóng)林大學(xué)遺傳學(xué)科種質(zhì)資源圃， 來源于湖南、 江西、 云南、 江蘇、 浙江、 安徽及國外等， 取正常生長的嫩葉， 于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?共用34 份材料：1～3 為栽培石蒜Lycoris radiata， 4～6 為栽培稻草石蒜L. straminea， 7～9 為栽培玫瑰石蒜L. rosea， 10～11 為野生江蘇石蒜L. houdyshelii， 12～13 為野生乳白石蒜L. albiflora， 14～15 為野生紅藍(lán)石蒜L. haywardii， 16～18 為栽培換錦花L. sprengeri， 19～21 為野生長筒石蒜L. longituba， 22～24 為栽培中國石蒜L. chinensis， 25～27 為栽培忽地笑L. aurea， 28～29 為來自日本的香石蒜L. incarnata， 30～31 為來自日本的夏水仙L.squamigera， 32～34 為石蒜與忽地笑的雜交種。

1.2 主要試劑

進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的各種試劑： Taq DNA 聚合酶， dNTPs， M. DL 3 000 標(biāo)記均購自生工生物工程（上海）有限公司， SCoT 引物根據(jù)Collard 等［7］和Mackill［8］公布的引物， 由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 石蒜屬植物基因組DNA 提取與檢測 石蒜屬植物基因組DNA 提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB）［13］， 用NanoDrop 微量分光光度計(jì)（ND-1000）測定DNA 的濃度和質(zhì)量， 并取適量樣品， 于10.0 g·kg－1瓊脂糖凝膠電泳檢測， 紫外凝膠成像系統(tǒng)Gene Genius Bio Imaging Ststem （BioRad）下觀察并照相， 其余DNA 樣品于－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 以第23 份材料中國石蒜DNA 為模板， P40 為擴(kuò)增引物。 針對影響PCR 反應(yīng)的5 個要素： DNA， 引物， dNTPs， Mg2+和Taq DNA 聚合酶， 采用正交設(shè)計(jì)L25（56）對SCoT-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。 設(shè)計(jì)水平5 個·因素－1（表1）， 重復(fù)3 次·處理－1（表2）。PCR 擴(kuò)增體系為20.0 μL， PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性35 s， 47～59 ℃（根據(jù)各引物的溶解溫度Tm值）退火35 s，72 ℃復(fù)性90 s， 35 個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min， 8 ℃保存［15］， 擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物于10.0 g·kg－1的瓊脂糖凝膠電泳檢測并用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

表1 正交試驗(yàn)的因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

表2 L25（56）正交設(shè)計(jì)表Table 2 Orthogonal design with L25（56）

1.3.3 單因素試驗(yàn) 根據(jù)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選出的最佳反應(yīng)體系設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)， 對各個因素進(jìn)行逐一優(yōu)化（表3）。

1.4 退火溫度優(yōu)化

在最佳反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上， 在溫度梯度PCR儀上設(shè)置12 個溫度梯度（47～59 ℃）對所用引物的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化， 擴(kuò)增產(chǎn)物于10.0 g·kg－1的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表3 SCoT-PCR 擴(kuò)增影響因子的梯度試驗(yàn)Table 3 Gradient experiment of factors influencing SCoT-PCR

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

參照桂騰琴 等［16］的方法， 根據(jù)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物譜帶的強(qiáng)度及清晰度、 雜帶的多少和背景的深淺對正交試驗(yàn)各個處理依次打分， 將條帶清晰、 豐富、 穩(wěn)定的最佳處理記 “25” 分， 最差的記“1” 分。 不同的引物， 不同的模板以及不同的重復(fù)分別獨(dú)立統(tǒng)計(jì)， 計(jì)算每個處理的平均分得分， 依據(jù)平均得分對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析， 列出正交試驗(yàn)的極差分析表以進(jìn)行直觀分析， 利用SPSS 17.0 對結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行方差分析， 綜合2 種分析方法確定最佳組合。

1.6 反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和通用性檢測

選取引物P40 對34 份石蒜屬植物DNA 模板進(jìn)行擴(kuò)增； 同時隨機(jī)選取7 條引物對中國石蒜的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物用10.0 g·kg－1的瓊脂糖凝膠電泳檢測以檢測優(yōu)化的SCoT-PCR 反應(yīng)體系的通用性、 穩(wěn)定性和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

圖1 SCoT-PCR 反應(yīng)體系正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Results of SCoT-PCR system with orthogonal design

2.1.1 直觀分析 由正交試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果見圖1。 25 個組合中23 個有譜帶產(chǎn)生， 其中1 號和12 號組合沒有擴(kuò)增出產(chǎn)物或產(chǎn)物極少， 4 號、 5 號、 7 號、 11 號和16 號擴(kuò)增譜帶清晰、 豐富。 依據(jù)譜帶的強(qiáng)弱、清晰度、 雜帶的多少以及背景的強(qiáng)弱對PCR 擴(kuò)增結(jié)果依次打分。 條帶數(shù)量豐富、清晰的最佳產(chǎn)物記25 分， 最差的計(jì)1 分。每次處理及重復(fù)分別獨(dú)立統(tǒng)計(jì)， 25個組合的分?jǐn)?shù)依次為2.00，5.33，12.67，19.67，18.33，15.67，20.67，15.67，3.67，13.67，21.67，1.00，17.33，13.33，7.67，18.67，8.00，16.67，16.33，7.33，17.00，20.00，12.00，10.33，10.33。再根據(jù)平均分算出每個因素同一水平下的試驗(yàn)值之和抑制常數(shù)Ki以及每一因素水平下的數(shù)據(jù)平均值ki， 并求出同一因素不同水平間平均值的極差R， 對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析（表4）。 根據(jù)極差大小可以判斷因素對反應(yīng)體系的主次影響順序。 R 越大， 表示該因素的水平變化對試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大， 因素越重要。 由以上分析可見， 因素影響主次順序?yàn)镸g2+＞Taq DNA 聚合酶＞引物＞dNTPs＞DNA 濃度， Mg2+對PCR 反應(yīng)體系影響最大， 為主要因素， DNA 濃度影響最小。 而根據(jù)各因素各水平的平均值可以確定優(yōu)水平， 進(jìn)而選出優(yōu)組合。 每一因素水平下的數(shù)據(jù)平均值ki反映了影響因素各水平對反應(yīng)體系的影響情況， ki值越大， 反應(yīng)水平越好。 由表4 可以知道： SCoT-PCR 反應(yīng)中5 個影響因素的最佳反應(yīng)水平組合并沒有在正交組合中出現(xiàn)， 但與分值最高的幾個組合都比較接近。

2.1.2 方差分析 雖然直觀分析具有直觀簡單、 計(jì)算量小等優(yōu)點(diǎn)， 但直觀分析法不能估計(jì)誤差的大小，不能精確地估計(jì)各因素的試驗(yàn)結(jié)果影響的重要程度， 而方差分析可以彌補(bǔ)直觀分析的這些不足， 得出更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果［17］。 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析（表5）， 結(jié)果表明： 鎂離子濃度和Taq DNA 聚合酶酶量對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響， DNA 模板濃度、 引物濃度和dNTPs 濃度對試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著， 各因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序與直觀分析結(jié)果一致。 圖1 和圖2 分別為5 個因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的趨勢圖， 由圖1～2 可知： 該P(yáng)CR 反應(yīng)體系的最佳組合也與直觀分析相一致。 經(jīng)多重考慮分析得出石蒜屬植物SCoT-PCR 反應(yīng)體系的最優(yōu)組合為： DNA 模板2.000 mg·L－1， 引物0.125 μmol·L－1， dNTPs 0.200 mmol·L－1， Mg2+3.000 mmol·L－1， Taq DNA 聚合酶1.0 × 16.67 nkat。

表4 正交試驗(yàn)直觀分析Table 4 Intuitive analysis of orthogonal design

圖2 DNA， 引物， dNTPs， Mg2+和Taq DNA 聚合酶5 個因素的效應(yīng)Figure 2 Curve effect of DNA, primer, dNTPs, Mg2+and Taq DNA polymerase

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

PCR 反應(yīng)對DNA 模板的純度要求不高， 但DNA 模板的用量過大會對Mg2+的有效濃度起到干擾作用， 會降低特異性擴(kuò)增效率， 增加非特異性產(chǎn)物或者使擴(kuò)增失敗， 而過少則可能擴(kuò)增不出條帶或條帶太弱不利于分析［15］。一般情況下， 100.0 μL 體系中加入100.0 ng 的量即可。 由圖3 可以看出： DNA 模板5 個濃度都能擴(kuò)增出豐富的譜帶， 但當(dāng)質(zhì)量濃度為2.000 mg·L－1時， 擴(kuò)增譜帶的質(zhì)量最好， 該結(jié)果與正交試驗(yàn)的結(jié)果相吻合。

引物是PCR 反應(yīng)的原料， 引物濃度過高會擴(kuò)增出非特異性譜帶， 引物濃度達(dá)到0.375 μmol·L－1時即出現(xiàn)特異性譜帶。 由圖3可以看出： 該SCoT-PCR 反應(yīng)體系中最佳引物濃度為0.125 μmol·L－1。

表5 應(yīng)用SPSS 17.0 進(jìn)行方差分析Table 5 Analysis of variances by SPSS 17.0

dNTPs 濃度直接影響PCR 擴(kuò)增， dNTPs與Taq DNA 聚合酶競爭Mg2+， 當(dāng)dNTPs 濃度較低時， 會影響合成效率， 直接影響擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度， 甚至引起產(chǎn)物單鏈化而影響擴(kuò)增 效 果［18］。 由 圖4 可 看 出， 當(dāng)dNTPs 濃度 為0.150 mmol·L－1和0.175 mmol·L－1時，擴(kuò)增出的條帶明顯比高濃度少， 經(jīng)綜合分析比較， 得出0.200 mm·L－1為該反應(yīng)體系中dNTPs 的最適合濃度。

Taq DNA 聚合酶在合成新DNA 鏈時，要求有游離的Mg2+。 Mg2+濃度太低無PCR 產(chǎn)物產(chǎn)生， 太高會導(dǎo)致非特異的產(chǎn)物產(chǎn)生［19］。 由 圖4 可 以 看 出： 當(dāng)Mg2+濃 度 為1.000 mmol·L－1時， 沒有PCR 產(chǎn)物產(chǎn)生， 當(dāng)Mg2+濃度為3.000 mmol·L－1時， 產(chǎn)生的譜帶清晰、 穩(wěn)定， 是該反應(yīng)體系中的最優(yōu)濃度。 而Taq DNA 聚合酶在5 個濃度下均能產(chǎn)生清晰穩(wěn)定的譜帶， 在考慮經(jīng)濟(jì)費(fèi)用及試驗(yàn)質(zhì)量的前提下， 將反應(yīng)體系中的酶濃度定為1.0 × 16.67 nkat。

圖3 DNA 模板濃度和引物濃度對SCoT-PCR 反應(yīng)的影響Figure 3 Effect of DNA template concentration and primer concentration on SCoT-PCR

圖4 dNTPs 濃度、 Mg2+濃度和Taq DNA 聚合酶濃度對SCoT-PCR 反應(yīng)的影響Figure 4 Effect of dNTPs concentration、 primer concentration and Taq DNA polymerase concentration on SCoT-PCR

石蒜屬植物SCoT-PCR 反應(yīng)的最優(yōu)體系為： DNA 模板2.000 mg·L－1， 引物0.125 μmol·L－1， dNTPs 0.200 mmol·L－1， Mg2+3.000 mmol·L－1， Taq DNA 聚合酶1.0×16.67 nkat。

2.3 SCoT-PCR 最佳退火溫度選擇

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)過程中， 退火溫度是影響PCR 產(chǎn)物特異性的重要因素， 退火溫度的高低直接影響引物與模板DNA 的特異性結(jié)合， 不同的引物退火溫度可能不同。 隨機(jī)選擇P13， P15， P16， P38， P39，P40， P57 等7 條SCoT 引物（表6） 進(jìn)行12 個不同退火溫度梯度試驗(yàn)， 其中引物P40 的擴(kuò)增結(jié)果見圖5。 在12 個退火溫度中， 退火溫度過低， 其擴(kuò)增出的條帶較少， 背景較強(qiáng)， 當(dāng)退火溫度接近最適溫時，擴(kuò)增的條帶清晰， 豐富， 背景較弱。 而退火溫度過高， 則引物與DNA 模板的特異性結(jié)合減弱， 擴(kuò)增產(chǎn)物減少， 條帶不清晰， 即溫度過高或過低擴(kuò)增效果均不理想， 因此， 確定引物P40 的最佳退火溫度為57.9 ℃。

2.4 SCoT-PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)的穩(wěn)定性和通用性檢測

一方面， 引物選取P40， DNA 模板選取石蒜屬植物不同種的34 份材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增； 另一方面，DNA 模板選取第23 號材料中國石蒜的DNA， 引物選取退火溫度試驗(yàn)中的7 條 （分別為P13， P15，P16， P38， P39， P40， P57）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 對優(yōu)化后的SCoT-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行穩(wěn)定性檢測， 結(jié)果均能獲得清晰可辨、 多態(tài)性豐富的條帶 （圖6～7）， 說明該優(yōu)化體系適用于石蒜屬植物的遺傳多樣性的分析。

表6 7 條SCoT 引物Table 6 Seven SCoT primers

圖5 不同退火溫度下SCoT-PCR 的擴(kuò)增結(jié)果Figure 5 Result of SCoT-PCR amplification at different annealing temperatures

圖6 34 份石蒜材料的SCoT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 6 SCoT-PCR amplification results in 34 Lycoris samplings

3 討論

3.1 SCoT 標(biāo)記的特點(diǎn)

SCoT 標(biāo)記作為一種新型的分子標(biāo)記， 已成功應(yīng)用于花生， 葡萄Vitis vinifera， 龍眼， 枇杷Eriobotrya japonica［20］，牡丹Paeonia suffruticosa［21］， 芒果Mangifera indica［22－23］和柑橘［24］等作物的遺傳育種和系統(tǒng)學(xué)分類研究， 可知該標(biāo)記在物種間的通用性較好。 SCoT 標(biāo)記的引物為單引物， 引物長度適中， 為18 個堿基的核苷酸。 在擴(kuò)增時， 可以同時結(jié)合在雙鏈DNA 的正義鏈與反義鏈上， 從而擴(kuò)增出引物之間的區(qū)域， 其錯配的幾率小， 產(chǎn)生的條帶豐富， 重復(fù)性好［11］。 且其PCR 產(chǎn)物可直接用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測， 其操作簡單， 用時短， 成本低； 而聚丙烯酰胺凝膠電泳操作復(fù)雜， 耗時， 成本較高且增加了影響因素［25］。 如果在用瓊脂糖凝膠電泳檢測時， 沒有呈現(xiàn)明顯的差異性， 可改用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳， 為我們的研究提供更多的選擇。 SCoT 標(biāo)記的不足主要在于其PCR 體系偏小且該標(biāo)記為顯性標(biāo)記， 不能區(qū)分雜合子與純合子， 即不能進(jìn)行雜交種的鑒定。

圖7 7 條引物的SCoT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure 7 SCoT-PCR amplification results in 7 primers

3.2 SCoT 標(biāo)記在石蒜屬中應(yīng)用的優(yōu)勢

由于石蒜屬植物種類豐富， 分布廣泛， 且一些形態(tài)相似的種其分布區(qū)域又存在重疊現(xiàn)象， 因此使該屬植物的物種鑒別、 親緣關(guān)系研究以及分類等問題復(fù)雜化。 之前關(guān)于石蒜屬植物的分子生物學(xué)研究中，不同的分子標(biāo)記其研究的結(jié)果存在一定的差異性， 對于該屬植物的親緣關(guān)系一直沒有定論。 在育種方面， 我們一直致力于選育矮干， 花型優(yōu)美， 花色較純的品種， 而SCoT 標(biāo)記作為一種可以追蹤性狀且通用性良好的新型標(biāo)記， 可為石蒜屬植物觀賞性狀的分子關(guān)聯(lián)技術(shù)及雜交育種提供一種新的方法， 且可對之前石蒜屬植物的遺傳多樣性分析進(jìn)行補(bǔ)充。

3.3 結(jié)論

本研究采用正交設(shè)計(jì)和單因素試驗(yàn)2 種方法對影響SCoT-PCR 反應(yīng)的5 個主要因素進(jìn)行了優(yōu)化， 首次建立了適用于石蒜屬植物遺傳多樣性分析的SCoT-PCR 擴(kuò)增體系， 其PCR 最佳組合為： DNA 模板2.0 mg·L－1， 引物0.125 μmol·L－1， dNTPs 0.200 mmol·L－1， 鎂 離 子（Mg2+）3.000 mmol·L－1， Taq DNA 聚合酶1.0×16.67 nkat。 對石蒜屬植物SCoT-PCR 反應(yīng)體系影響最顯著的因素是Mg2+濃度和Taq DNA 聚合酶濃度， 而dNTPs 濃度、 引物、 DNA 模板用量對該體系的擴(kuò)增結(jié)果無顯著影響， 與趙瑞強(qiáng)等［15］在鐵皮石斛Dendrobium officinale 上的研究結(jié)果基本一致。 退火溫度也是SCoT-PCR 反應(yīng)中的重要影響因子， 在本研究中得出每個引物的最適退火溫度在其（Tm±5 ）℃范圍內(nèi)， 與最初設(shè)計(jì)引物的標(biāo)準(zhǔn)一致。 本研究將優(yōu)化的SCoT-PCR 體系在石蒜屬不同種及雜交種上進(jìn)行通用性及穩(wěn)定性驗(yàn)證， 均得到了特異性豐富的譜帶，即表明ScoT 標(biāo)記適于石蒜屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

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