凝膠滲透色譜-液相色譜法測定熏烤肉制品中的苯并（a）芘

鄭睿行，夏愛萍，祝華明，張旭，鮑利鋒

（衢州市質量技術監(jiān)督檢測中心，浙江衢州 324002）

熏烤肉制品中多環(huán)芳烴主要來源于加工過程中有機物的不完全燃燒并在肉制品表面沉積，脂肪、蛋白質等有機物在高溫下的分解[1-3]。現(xiàn)在已知的熏烤肉制品中多環(huán)芳烴（PAHs）[4-7]，其中以苯并（a）芘（benzo（a）pyrene，簡稱B（a）P）為代表，是一種強致癌物，它是多環(huán)芳烴類中毒性最大的一種，其毒性超過黃曲霉毒素。食用受其污染的食品，具有公認的致畸、致癌的慢性毒性，在熏烤過程中嚴重污染食品。目前許多國家已將PAHs 列為食品有害物質監(jiān)測的重要內(nèi)容之一，其中苯并（a）芘的關注程度最為廣泛，德國已對肉制品中苯并（a）芘的殘留制定了限量標準1 μg/kg，我國國標GB 2762-2005《食品中污染物限量》限定苯并（a）芘在肉制品中的最高殘留量為5 μg/kg。

苯并（a）芘的檢測方法已經(jīng)有國標法GB/T 5009.27-2003《食品中苯并（a）芘的測定》以及不少研究文獻提供的方法[8-9]，但其測定方法仍有諸多不足之處，尤其是對樣品中苯并（a）芘提取[10-11]、凈化與濃縮方面缺乏先進的方法。目前報道的凈化技術主要有固相萃取、液-液萃取等方法。凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatograph，GPC）作為一種新型的樣品凈化技術，已經(jīng)成功應用于各類中藥類樣品、環(huán)境樣品和食品樣品進行分析。熏烤肉制品中含有大量的高分子物質，比如色素、油脂、糖類等，造成色譜分離效率大大降低，所以這類樣品必須進行有效的凈化。

本研究應用全自動凝膠滲透色譜和固相萃取技術對熏烤肉制品進行提取、凈化并定量濃縮，并結合反相高效液相色譜-熒光法對GPC 處理后的樣品進行分析，建立一種檢測熏烤肉制品中苯并（a）芘殘留的分析方法。該方法快速簡便，自動化程度高，可進行大批量自動化分析，靈敏度高且重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 試劑與材料

熏烤肉制品：市售；苯并（a）芘標準品（純度≥99%）：國家標準物質中心；乙腈（HPLC 純）、環(huán)己烷（農(nóng)殘級）、乙酸乙酯（農(nóng)殘級）：美國J.T.Baker 公司；高純氮（純度≥99.999%）：浙江巨化股份有限公司；水（去離子化純凈水）。

1.1.2 實驗儀器

1.2 樣品的制備

將烤肉攪碎，勻質。準確稱取5.00 g 于離心管中，加入30 mL 正己烷∶丙酮（1 ∶1，體積比）混合溶液，超聲提取40 min。提取液4 000 r/min 離心10 min，上清液氮吹濃縮至干，用環(huán)己烷/乙酸乙酯（1 ∶1，體積比）溶解并定容至10 mL，劇烈搖勻，4 000 r/min 離心10 min，上清液轉移至16 mL 進樣瓶中，通過GPC 二聯(lián)機模式對樣品進行凈化，凈化后濃縮，用環(huán)己烷/乙酸乙酯（1 ∶1，體積比）定容至2 mL，最后收集1 500 μL 洗脫液到玻璃樣品瓶中，用氮氣吹至近干，用1.5 mL 正己烷：丙酮（1 ∶1，體積比）混合液溶解殘渣，過預先用5 mL正己烷活化的硅膠柱，收集洗脫液，氮吹至干，用乙腈定容至750 μL，小心渦旋溶解殘渣，避免樣品瓶蓋與溶劑接觸。然后將10 μL 試樣液注入高效液相色譜儀進行測定。

2 結果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)相關參考文獻報道，初選出有代表性的二氯甲烷、丙酮、正己烷。采用超聲波輔助提取法比較以上3 種溶劑及其混合液的提取效果。通過考察苯并（a）芘提取效率，發(fā)現(xiàn)正己烷和丙酮混合液的提取效果最高。分別添加相同體積但比例不同的正己烷和丙酮提取液進行進一步的優(yōu)化實驗，結果發(fā)現(xiàn)，60%（體積比）正己烷丙酮溶液作為樣品提取溶液時，所得到的提取物中苯并（a）芘含量最高。

2.1.2 提取時間的選擇

選擇不同的提取時間（10、20、30、40、60、80 min）進行實驗。結果表明，在40 min 內(nèi)，隨著超聲時間的增加，待測物提取率明顯增加，但超聲時間40 min 后，提取率基本無變化，因此本實驗提取時間為40 min。

2.2 GPC 凈化條件的選擇

2.2.1 凈化樣品量的選擇

分別稱取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g 熏烤肉制品，按1.2 所述方法進行提取，結果表明，當凈化樣品量為2.0 g 時不能滿足儀器的方法檢出限；當凈化樣品量在4.0 g～6.0 g 時能夠達到添加回收標準且能滿足儀器的檢測要求；當凈化樣品量大于8.0 g 時，基質干擾大，凈化效果不理想。因此凈化樣品量宜在4.0 g～6.0 g。

2.2.2 收集時間的確定

設置流速為5.0 mL/min，以2 min 為間隔，分段收集。檢測結果顯示，目標物均在21 min 以后出峰，且在42 min 內(nèi)收集完畢。故將收集時間設定為前運行時間：1 300 s；主收集時間：1 200 s；脫尾時間：300 s。

2.3 GPC 的凈化濃縮條件

GPC 柱：500 mm×25 mm glass column，Bio-Beads，TypeS-X3，200-500；樣品定量環(huán)：5.0 mL；流速：5 mL/min；油浴溫度：40 ℃；循環(huán)冷卻水溫度：4.0 ℃；前運行時間：1 300 s；脫尾時間：300 s；主收集時間：1 200 s；樣品收集體積：1 500 μL；真空參數(shù)（階段1 壓力：180 mbar，階段2 壓力：200 mbar）。

2.4 反相高效液相色譜檢測條件

高效液相色譜儀配備熒光檢測器；色譜柱：多環(huán)芳烴分析柱（Eclipse PAH，4.6×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（92 ∶8，體積比）；波長：激發(fā)波長384 nm（狹縫10 nm），發(fā)射波長406 nm（狹縫10 nm）；流速：1.2 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。在此條件下，測得苯并（a）芘保留時間15.253 min，樣品溶液中主峰和其它雜峰達到完全分離。標準品、樣品的色譜圖見圖1、圖2。

圖1 苯并（a）芘標準溶液色譜圖Fig.1 RP-HPLC chromatogram of Benzo（a）Pyrene standard substance

圖2 熏烤肉制品的RP-HPLC 色譜圖Fig.2 RP-HPLC chromatogram of the Smoked meat products

2.5 方法的線性范圍、相關系數(shù)及儀器檢出限

按選定的色譜條件對苯并（a）芘標準系列濃度進行RP-HPLC 分析，以保留時間定性，以峰面積對濃度繪制工作曲線圖1，圖1 結果表明，在0～20 μg/L 范圍內(nèi)，其線性回歸方程為y=1.353 8x－0.204 5，線性相關系數(shù)r2=0.999 6。連續(xù)11 次進空白樣，以基線3 倍噪聲值在標準曲線查得結果，并通過計算得出樣品方法檢出限為0.15 μg/kg。

圖3 苯并（a）芘標準品標準曲線Fig.3 The standard curve for Benzo（a）Pyrene standard substance

2.6 方法精密度和加標回收試驗

向5.00 g 左右的無苯并（a）芘殘留的熏烤肉制品中加入20.0、50.0、100.0 ng 的苯并（a）芘標準物質。按照本文1.2 處理方法對樣品進行前處理，在本文所述的最佳色譜條件下，每個濃度進行6 次平行試驗，外標法計算平均回收率，結果見表1。

從表1 可見，加標回收率范圍在85.9%～94.3%之間；RSD 在2.8%～4.6%，均小于5%，說明該方法具有較高的可靠性，系統(tǒng)誤差小，精密度高，符合實驗要求。

表1 回收率實驗測定結果（n=6）Table 1 Determination results of recovery（n=6）

2.7 質控樣品比對試驗

本方法用5 種不同濃度的質控樣品進行測試分析。精確稱取5.00 g 左右熏烤肉制品，按照本文所述的GPC 凈化濃縮條件對樣品進行前處理，用最佳的HPLC 色譜條件對樣品進行分析。測定結果見表2。

表2 質控樣品的苯并（a）芘測定值與結果Table 2 QC sample by Benzo（a）Pyrene determination and results

從表2 可見，3 種不同濃度的質控樣品的測定值與實際參考值進行比對，相對偏差為3.5%～7.6%，分析結果準確，可靠，方法具有廣泛的應用價值。

3 結論

1）熏烤肉制品基質成分復雜，大分子有機物種類繁多，前處理不好直接影響檢測結果的判定。與GB/T 5009.27-2003《食品中苯并（a）芘的測定》的前處理方法相比，本文采用的凝膠滲透色譜制備樣品可以提高分析的準確度和精密度，并且大大提高了工作效率。

2）本研究采用凝膠滲透色譜-固相萃取-高效液相色譜聯(lián)用技術對熏烤肉制品中苯并（a）芘殘留量進行測定，以保留時間定性，外標法定量。結果表明：苯并（a）芘在0～20 μg/L 的濃度范圍內(nèi)，其線性相關系數(shù)是0.999 6，最低檢出限為0.15 μg/kg，加標回收率為85.9%～94.3%，相對標準偏差為2.8%～4.6%。該方法是一種快速、靈敏、穩(wěn)定可靠的測定熏烤肉制品中苯并（a）芘殘留量的方法，對五種不同濃度質控樣品進行了測試分析，均獲得了滿意的結果，符合熏烤肉制品中苯并（a）芘殘留量檢測的技術要求。

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