海洋酵母內(nèi)海藻糖的提取方法研究

趙玉巧，杜云建，王微，趙強(qiáng)

（淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港 222005）

海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子組成的一個(gè)非還原性雙糖[1]，它有3 種異構(gòu)體，分別是α，α-、α，β-和β，β-海藻糖，天然存在的異構(gòu)體是α，α 型海藻糖[2]，廣泛存在于各種生物體中，包括細(xì)菌、酵母、真菌和藻類以及一些昆蟲、無脊椎動(dòng)物和植物中。海藻糖在水中溶解性好且很穩(wěn)定，在120 ℃加熱90 min 無褐變[3]，還可防御如高溫、冷凍、脫水和高滲透壓等不利環(huán)境因素，該特性已被廣泛運(yùn)用于食品、化妝品、醫(yī)藥品等行業(yè)[4]，2000 年美國(guó)及聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織均允許海藻糖可無限量加入食品中[5]。

目前海藻糖在我國(guó)已有生產(chǎn)，但價(jià)格還很高，限制了它的大規(guī)模應(yīng)用。用酵母生產(chǎn)海藻糖的關(guān)鍵技術(shù)主要是酵母中海藻糖的產(chǎn)量及簡(jiǎn)單、高提取率的提取純化方法。提取海藻糖的方法有水提取法、乙醇提取法、三氯乙酸提取法及微波預(yù)處理提取法等，本文以高產(chǎn)量的酒香酵母為材料，系統(tǒng)地研究從酵母中提取海藻糖的方法，以期達(dá)到提取方法簡(jiǎn)單、高效的目的，為酵母提取海藻糖的工業(yè)生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

由淮海工學(xué)院海洋生物活性物質(zhì)研究實(shí)驗(yàn)室從海水中篩選酒香酵母。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 斜面培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，補(bǔ)煮沸過濾陳海水至1 000 mL，pH 自然。

1.1.2.2 種子及發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂0.2g，補(bǔ)煮沸過濾陳海水至1000mL，pH6.5。

1.1.3 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：250 mL 三角瓶裝液量為100 mL，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)時(shí)間24 h。

搖瓶培養(yǎng)條件：接種量為8%，培養(yǎng)時(shí)間60 h，其余條件與種子培養(yǎng)相同。

濕酵母制備：將發(fā)酵液以8 000 r/min 的速度除去上清液，加蒸餾水洗滌2 次，濕酵母放冰箱貯存待用。

1.2 方法

1.2.1 海藻糖的測(cè)定方法

硫酸-蒽酮法[6]。

1.2.2 提取率的確定

用三氯乙酸提取5 次測(cè)得的海藻糖含量總和作為酵母內(nèi)海藻糖含量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 提取方法的研究

1.2.3.1 三氯乙酸提取

在1 g 濕酵母中加10 mL 三氯乙酸溶液（0.5 mol/L）于冰水浴中提取30 min，將提取液以8 000 r/min 的速度離心5 min，取上清液待測(cè)。重復(fù)上述步驟，共提取10 次。

1.2.3.2 超聲波輔助提取

在1 g 濕酵母中加10 mL 蒸餾水，攪拌均勻后用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理15 min，在80 ℃水浴提取60 min，離心后菌體再重復(fù)上述步驟提取4 次。

1.2.4 乙醇提取條件研究

1.2.4.1 乙醇濃度及加入量選擇

在1 g 濕酵母中分別加入乙醇濃度為50%、55%及60%水溶液各6、7、8、9、10 mL，用磁力加熱攪拌器攪拌加熱回流提取60 min，離心后菌體再重復(fù)上述步驟提取1 次，結(jié)果為兩次提取之和。

1.2.4.2 乙醇提取時(shí)間的選擇

在1 g 濕酵母中加55%乙醇9 mL，用磁力加熱攪拌器分別加熱回流提取30、60、90、120 min，離心后菌體再重復(fù)上述步驟提取1 次，結(jié)果為兩次提取之和。

1.2.5 水提取條件研究

1.2.5.1 干、濕酵母的水提取結(jié)果研究

在1 g 濕酵母及0.34 g 干酵母（相當(dāng)于1 g 濕酵母）中分別加10 mL 蒸餾水并攪拌均勻，放入80 ℃的水浴鍋中提取60 min。

1.2.5.2 水加入量的選擇

在1 g 干酵母中加6、8、10、12、14 mL 蒸餾水并攪拌均勻，放入80 ℃的水浴鍋中提取60 min。

1.2.5.3 提取溫度的選擇

在1 g 干酵母中加12 mL 蒸餾水并攪拌均勻，分別在50、60、70、80、90 ℃的水浴鍋水浴提取60 min。

1.2.5.4 提取時(shí)間的選擇

在1 g 干酵母中加12 mL 蒸餾水并攪拌均勻，在90 ℃水浴鍋中分別提取15、30、45、60、75、90 min，離心后菌體再重復(fù)上述步驟提取1 次，結(jié)果為兩次提取之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 三氯乙酸提取結(jié)果

三氯乙酸對(duì)酵母中海藻糖提取的影響見圖1。

圖1 三氯乙酸提取結(jié)果Fig.1 Result of trechioroacetic acid extraction

由圖1 中可以看出，三氯乙酸提取濕酵母中海藻糖，前三次的提取率分別為83.3%、9.6%、3.3%，前三次提取率總和達(dá)到了96.2%。后面7 次的提取總和，僅占海藻糖總量的3.8%。用三氯乙酸提取酵母中海藻糖效果較好，但考慮到三氯乙酸提取雜質(zhì)多會(huì)使精制過程變得繁瑣復(fù)雜，消耗的成本非常高，另外，廢水處理復(fù)雜，從三次提取率較高的結(jié)果看，該方法用于分析海藻糖時(shí)較好。

2.2 超聲波輔助提取結(jié)果

超聲波對(duì)酵母中海藻糖輔助提取的結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波及水提取結(jié)果Fig.2 Result of ultrasound and water extraction

從圖2 中可以看出，超聲波輔助提取濕酵母中海藻糖，第一次的提取率為95.1%，前3 次提取率總和達(dá)到了99.1%，提取效果很好，但該方法可使大量大分子物質(zhì)釋放出來，純化時(shí)如果采用膜法去除大分子物質(zhì)，則可簡(jiǎn)化純化步驟降低成本。

2.3 乙醇提取條件研究結(jié)果

2.3.1 乙醇濃度及提取液體積對(duì)提取率的影響

乙醇濃度及提取液體積對(duì)酵母中海藻糖提取的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度級(jí)提取液體積對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration and volume on extraction rate

從圖3 可以看出，采用3 種濃度的乙醇溶液提取酵母中海藻糖時(shí)，50%乙醇溶液的提取效果最差，而55%的乙醇溶液提取率在所加的提取液體積范圍內(nèi)均最高。另外，隨著提取液體積的增多，海藻糖的提取率為逐漸升高的趨勢(shì)，但至提取液體積為9 mL 時(shí)，用55%的乙醇溶液做提取液其提取率升高趨勢(shì)變緩，考慮到提取液體積越多，分離時(shí)設(shè)備的體積越大，使設(shè)備成本增加，故選擇1 g 濕酵母中加入55%的乙醇溶液9 mL 進(jìn)行提取。

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)酵母中海藻糖提取率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

選擇55%乙醇作為提取液，其加入量為9 mL，考察提取時(shí)間的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示，從圖4 可見，提取時(shí)間低于60 min 時(shí)，提取率較低，高于60 min后提取率上升緩慢，雖然120 min 提取率最高，達(dá)到83.6%，但其僅比90 min 高1.7%，考慮到生產(chǎn)效率及產(chǎn)品收率等因素，提取時(shí)間以90 min 為宜，由圖4 可見，該條件下的兩次提取率為81.9%。

2.4 水提取條件研究結(jié)果

2.4.1 干、濕酵母的水提取結(jié)果

將培養(yǎng)后離心得到的濕酵母與烘干后的干酵母分別進(jìn)行水提取試驗(yàn)，結(jié)果如表1 所示。

表1 干、濕酵母的水提取結(jié)果Table 1 Result of water extraction on dry and wet yeast

從表1 中可以看出，干酵母第一次提取的提取率遠(yuǎn)高于濕酵母，原因可能是烘干后又加水提取的酵母，重新吸水后細(xì)胞膜及細(xì)胞壁易破裂，使海藻糖易于釋放，從干酵母第二次提取率低于濕酵母來看，也與上述推斷吻合。由兩次提取的結(jié)果可見，用干酵母加水提取其效果明顯優(yōu)于濕酵母。

2.4.2 加水量對(duì)海藻糖提取的影響

加水量對(duì)海藻糖提取結(jié)果的影響見圖5 所示。

圖5 加水量對(duì)提取率的影響Fig.5 Effect of water volume on extraction rate

由圖5 可見，隨著水加入量的增多，一次提取率比總提取率上升趨勢(shì)快些，原因是提取次數(shù)越多菌體中殘留的海藻糖越少，使加水量對(duì)其影響變小。在加水量超過12 mL 后，無論是一次提取率還是總提取率上升趨勢(shì)均變緩，可見，加水量太多的話對(duì)提取率增加效果不佳，相反，加入太多的水會(huì)增加處理量，從而使設(shè)備成本增加，因此，選擇最佳加水量為12 mL較好。

2.4.3 溫度對(duì)海藻糖提取的影響

溫度對(duì)酵母中海藻糖提取的影響見圖6。

圖6 溫度對(duì)提取率的影響Fig.6 Effect of temperature on extraction rate

由圖6 可見，提取溫度高于70 ℃時(shí)，提取率較50、60 ℃有顯著增加，原因可能是溫度超過70 ℃海藻糖的溶解性及分子的擴(kuò)散性均較好，但提取溫度高于70 ℃后，提取率升高趨勢(shì)變緩，當(dāng)提取溫度為90 ℃時(shí)，總提取率可達(dá)81.2%，故選擇提取溫度為90 ℃。

2.4.4 水提取時(shí)間對(duì)海藻糖提取的影響

水提取時(shí)間對(duì)酵母中海藻糖提取率的影響見圖7。

圖7 水提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.7 Effect of water extraction time on extraction rate

由圖7 可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，在提取時(shí)間為30 min 前，提取率升高很快，但30 min 后上升緩慢，當(dāng)提取時(shí)間為90 min 時(shí)，提取率雖最高，但考慮到生產(chǎn)中生產(chǎn)效率必須較高，提取時(shí)間不可能無限延長(zhǎng)，從圖7 中的結(jié)果看，提取時(shí)間為60、75、90 min時(shí)，其兩次提取率分別為79.4%、86.6%和88.7%，可見提取時(shí)間選擇75 min 即可得到較滿意的結(jié)果。

3 結(jié)論

1）用三氯乙酸提取酵母中海藻糖前三次提取率總和達(dá)到了96.2%，提取效果較好，但該方法用于工業(yè)生產(chǎn)有很多弊端，用于海藻糖的分析較好。

2）超聲波輔助提取酵母中海藻糖，一次提取率可達(dá)95.1%，三次總提取率為99.1%，其效果很好，但超聲波目前還不能處理大批量的物料，僅適用于小批量物料的處理，另外，其提取效果好的主要原因是使酵母細(xì)胞破碎海藻糖從細(xì)胞中釋放出來，但同時(shí)也釋放出大量的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，若用膜法處理可簡(jiǎn)化純化步驟。

3）試驗(yàn)得到乙醇水溶液的最佳提取條件為：1 g濕酵母中加入55%的乙醇溶液9 mL，提取時(shí)間90 min，該條件下的兩次提取率為81.9%。對(duì)水提取采用干酵母比濕酵母提取效果好，得到水提取的最佳條件為：1 g 干酵母中加入12 mL 水，提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間75 min，該條件下的兩次提取率為86.6%。比較水提取與乙醇提取的結(jié)果，我們可以看出兩種方法提取率相差不大。比較提取條件可以看出，水提取的溫度高于乙醇水溶液提取，但提取時(shí)間比乙醇水溶液短?？紤]到乙醇的成本比水的成本高，回收比較麻煩，所以，對(duì)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，選擇水提取方法來制備海藻糖比較適宜。

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