響應(yīng)面法對牛喉管軟骨多糖提取的工藝優(yōu)化

陳宏碩，王維君，李曉穎，宋雪梅

（1.河北聯(lián)合大學電氣工程學院，河北唐山 063009；2.天津市食品加工工程中心，天津 300457）

多糖種類繁多，來源廣泛，它們廣泛存在于動物、植物、微生物（細菌和真菌）和海藻中。它們又可分為胞外和胞內(nèi)多糖，其中研究得比較多的是植物多糖和微生物多糖。而動物軟骨中除含有豐富的磷、鈣、微量元素外，還含有大量的膠原蛋白和酸性粘多糖。酸性粘多糖是構(gòu)成動物結(jié)締組織的特有成分之一，植物中幾乎不含有。動物軟骨中起作用的主要是多糖物質(zhì)，動物多糖主要由糖原、甲殼素、肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸等復(fù)合而成[1]，本文主要針對牛喉管軟骨多糖的提取工藝條件進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛喉管軟骨、堿性蛋白酶、胰蛋白酶：均為天津市諾奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；硫酸軟骨素abc 酶：美國sigma 公司產(chǎn)品；乙醇、苯酚、硫酸、咔唑、硼砂、過硫酸胺、十二烷基磺酸鈉均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HW·SY21-K4 系列電熱恒溫水浴鍋：北京長風儀器廠；PHS.3C 型pH 計：上海嘉鵬科技有限公司；高效液相色譜（HPLC）儀：日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 多糖的提取工藝研究

工藝路線圖[3-6]：組織脫脂、脫鈣→加入水解酶（堿性蛋白酶，胰蛋白酶）雙酶進行酶解→酶解液除蛋白（三氯乙酸→3 倍體積醋酸鉀-乙醇混合液4 ℃沉淀過夜→8 000 轉(zhuǎn)離心30 min，得沉淀物Ⅰ→沉淀物用0.2 mol/L 的NaCl 液溶解8 000 轉(zhuǎn)離心30 min，取上清→加入0.5 mL 的十六烷基吡啶鹽（5%）→離心得沉淀Ⅱ，再用2.5 mol/L 的NaCl 鹽溶解→用5 倍體積的乙醇沉淀→10 000 r 離心30 min，得到多糖提取物。

按照下式計算多糖提取率：多糖提取率%=多糖的質(zhì)量/提取前樣品質(zhì)量×100%

1.3.2 酸性多糖含量測定

動物軟骨多糖中主要是含有酸性多糖，根據(jù)由Bitter 和Muir 改良的咔唑法（葡糖醛酸含量計）測定多糖含量。分別測定不同濃度葡萄糖醛酸標準溶液的吸光度，繪制標準曲線，并計算出吸光度和濃度的線性回歸方程。取樣品0.1 g/L 的溶液1 mL，按照標準曲線項下的方法測定吸光度，在標準曲線上查出相應(yīng)的葡糖醛酸濃度，按下式計算酸性多糖含量：葡萄糖醛酸%=標準曲線查出的濃度/樣品濃度×100%

1.3.3 軟骨多糖的HPLC 分析

參照牛增元等[7-8]的方法進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

根據(jù)前期單因素試驗研究結(jié)果，確定溫度、pH、攪拌時間為影響多糖提取率的3 個關(guān)鍵因子，并且單因素實驗多糖提取率最大值為18.13%。因此，采用三因素四水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗來確定多糖提取率的條件。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken 實驗設(shè)計

根據(jù)前期單因素試驗研究結(jié)果，表明溫度、pH、攪拌時間為影響多糖提取率的3 個關(guān)鍵因子。因此，采用Box-Behnken 模型，分別以X1、X2、X3來表示關(guān)鍵因子（自變量），+1、0、-1 代表其高、中、低水平。實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理采用輔助軟件SAS 8.0 來完成。表1 列出了各自變量的實驗水平范圍及其編碼。采用多元回歸技術(shù)，擬合二次多項模型的Box-Behnken 設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnke 實驗因素水平Table 1 Experimental variables and levels for Box-Behnke

依據(jù)Box-Behnke 中心組合實驗設(shè)計原理，以X1（溫度）、X2（pH）、X3（攪拌時間）為自變量，以多糖喉管骨多糖得提取率Y（mg/mg，%）為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面分析試驗，Box-Behnke 實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

以多糖提取率為響應(yīng)值，根據(jù)表2 中Box-Behnken 設(shè)計的實驗結(jié)果，利用SAS 軟件對其結(jié)果進行二次回歸分析，得回歸方程（predictivemodelforY1），對其回歸方程的方差分析見表3。

表2 Box-Behnke 實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnke

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

其中：Y1代表喉管骨的多糖提取率響應(yīng)值。

從回歸方程的方差分析表3 中可以看出模型在α=0.01 水平上回歸顯著。模型可信度分析見表4，其中復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.954 1，說明模型可以解釋95.41%實驗所得多糖提取率的變化，表明方程擬合較好。CV（Y 的變異系數(shù)）表示實驗的精確度，CV 值越高，實驗的可靠性越低，本設(shè)計實驗中CV=2.146 1%，較低，說明實驗操作可信。綜上說明回歸方程給喉管骨多糖提取率提供了一個合適的模型。

2.2.2 響應(yīng)面分析及最佳提取條件的確定

根據(jù)以上實驗結(jié)果，對模型的可信度分析見表4。

表4 模型的可信度分析Table 4 Fit statistics for model

通過回歸方程來繪制分析圖，以考察所擬合響應(yīng)曲面的形狀，響應(yīng)曲面立體分析見下圖1。

圖1 Y=f（X1，X2）響應(yīng)面立體圖Fig.1 Y=f（X1，X2）Responsive surface plot

綜上所述，從圖中及軟件分析，回歸方程存在穩(wěn)定點，穩(wěn)定點是極大值點。通過嶺嵴分析（ridgeanalysis）得到極大值所對應(yīng)的各主要因素（X1，X2，X3）的編碼值分別為：喉管骨（-0.158 85，0.520 82，-0.165 37），即溫度、pH、攪拌時間的最佳值分別為53.4 ℃、8.23、9.3 h，此時喉管骨多糖提取率可達20.19%。

2.2.3 實驗結(jié)果驗證

以2.2.2 確定的主要因素條件來提取多糖，喉管骨多糖提取率均值20.05%，與預(yù)測值20.19%是非常接近的；同時，與單因素實驗的最大提取率相比提高了10.59%?？梢?，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件可行，回歸模型較可靠。

2.3 牛喉管骨軟骨多糖中酸性多糖含量分析

取含0.1 g/L 樣品的溶液1 mL，按照1.3.2 方法測定吸光度，然后計算出多糖含量。單因素實驗中測定其中的酸性多糖含量最高34.94%，而提取條件優(yōu)化后結(jié)果顯示喉管骨中酸性多糖含量為39.58%，酸性多糖含量相比提高了10.3%。

2.4 牛喉管軟骨多糖液相分析

喉管骨多糖樣品經(jīng)處理后，通過高效液相色譜法得出喉管骨的液相色譜見圖2。

圖2 喉管骨軟骨多糖的液相色譜圖Fig.2 The liquid chromatogram of throat cartilage polysaccharides

從圖2 可以看出，喉管骨多糖的出峰位置是2.56 min，與標準品硫酸軟骨素出峰位置2.69 min 相比延遲了，原因可能與自身某種基團的結(jié)構(gòu)有關(guān)。而且牛喉管軟骨多糖在主峰后面有一個小峰，可能是糖蛋白。

3 結(jié)論

1）通過單因素和響應(yīng)面設(shè)計實驗最終確定軟骨多糖的最佳提取工藝條件，即溫度、pH、攪拌時間的最佳值分別為53.41 ℃、8.23、9.33 h；此條件下的多糖提取率是20.05%，酸性多糖含量達39.58%。

2）通過液相色譜分析，初步推斷出牛喉管軟骨多糖為類硫酸軟骨素多糖，說明優(yōu)化工藝能夠保持牛喉管軟骨中的酸性多糖品質(zhì)。

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