油茶籽油抗氧化及對自由基清除作用研究

徐俐，耿陽陽，張紅梅

（貴州大學生命科學學院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室，貴州貴陽 550025）

油茶籽油（Camellia Oleifera Oil）是從山茶科山茶屬灌木植物油茶（Camellia ofeifera Abel）的種子中提取出來的油脂。因其脂肪酸組成與世界著名的優(yōu)質(zhì)食用橄欖油十分相似，故素有“東方橄欖油”之稱。油茶籽油，色佳味香，營養(yǎng)豐富，具有重要的醫(yī)藥價值[1]，經(jīng)深加工后可制成高級護膚化妝品、精油和皂素等系列產(chǎn)品。大力發(fā)展油茶籽油，對促進我國經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義[2]。

茶多酚是一種性能十分優(yōu)異的天然抗氧劑，因其抗氧化性高于合成抗氧化劑，天然無毒副作用等特點，近年來成為各工業(yè)化國家的技術(shù)競爭和研究開發(fā)的目標[3]。茶多酚應(yīng)用在油脂中能有效延長貯藏期[4]。黃佳聰?shù)妊芯苛蓑v沖紅花油茶籽油中多酚類物質(zhì)具有較強的清除自由基的作用[5]，茶油中多酚類物質(zhì)較高，具有較強的穩(wěn)定性，是否配合茶多酚使用，即增強對氧化穩(wěn)定性，又對自由基的清除作用協(xié)同作用，少見報道。因此，研究茶多酚在油茶籽油應(yīng)用，將大大拓展油茶籽油的應(yīng)用市場，解決油茶籽油期貯藏存在的氧化問題，并對人們的健康、拉動我國糧油市場經(jīng)濟起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料冊享油茶籽油，2012 年2 月購于貴州省冊亨縣市場；98%茶多酚，無錫世紀生物科技公司生產(chǎn)；99.83%特丁基對苯二酚（TBHQ）：東莞市廣益食品添加劑實業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑

2，2-二苯基-1-苦肼基自由基（DPPH）標準品，Singma 公司；三吡啶三吖嗪（TPTZ）、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、雙氧水、硫酸亞鐵、乙醇、冰乙酸、溴水、異辛烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、氫氧化鉀、乙醚、沒食子酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉、碳酸鈉、磷酸、硫酸鋰等均為分析純。

FC 顯色劑[5]：將10 g 鎢酸鈉、2.5 g 鉬酸鈉、350 mL蒸餾水、5 mL85%磷酸及10 mL 濃鹽酸加入帶回流裝置的500 mL 圓底燒瓶中，充分混合，微沸回流2 h 再加入15 g 硫酸鋰，5 mL 蒸餾水及數(shù)滴溴水，開口沸騰20 min（至溴水揮發(fā)為止），冷卻定容至100 mL，過濾，置棕色瓶中，冷藏保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r加入1 倍蒸餾水稀釋。

FRAP 工作液[5]：用40 mmol/L 鹽酸溶液溶解，配成1.6 mmol/L TPTZ 溶液，配制pH3.6、300 mmol/L 的醋酸鹽緩沖液和20 mmol/LFeCl3溶液。三者按1 ∶100 ∶1 的比例混合，即可配成FRAP 工作液。

1.1.3 儀器與設(shè)備

AE100S 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SRZ-JJI 循環(huán)水式多用真空泵：上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；RE-5298 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SK-1 快速混勻器：武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司；XMTD-204 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TU-1810PC 紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 制備添加抗氧化劑的油茶籽油

分別稱取質(zhì)量濃度為98%的茶多酚，溶于少量無水乙醇中，加入1.8 g 的磷脂，混勻后加入450 g 油茶籽油，攪拌均勻，得質(zhì)量濃度為0.02%、0.03%、0.04%的茶多酚（TP）處理油；再稱取TBHQ 溶于450 g 茶油中，得到質(zhì)量濃度為0.02%TBHQ 的茶油；與不添加的油茶籽油（CK）為對照，分別混勻后，裝入玻璃瓶中，一起放置在（62±2）℃恒溫箱中進行抗化氧化實驗，每24 h 測定油茶籽油的過氧化值（POV）和酸值，并轉(zhuǎn)換各組在烘箱中的位置，貯藏前后提取極性酚類，測定對總抗氧化活性及對DPPH 清除率、羥基陰離子和超氧陰離子的抑制率。

1.2.2 油茶籽油的過氧化值測定

參照GB/T5538—2005[6]。

1.2.3 油茶籽油的酸值的測定

參照GB/T5530—2005[7]。

1.2.4 多酚類物質(zhì)的提取

參閱Folin—Ciocalteau[8]。

貯藏前后分別稱取油茶籽油各（100±0.50）g，分別用80%乙醇按油醇體積比1 ∶3 加入乙醇，置于50 ℃恒溫水浴鍋中萃取30 min，3 000 r/min 下離心5 min 收集上層離心液，重復3 次合并離心液，經(jīng)真空濃縮，稱重得待測樣品液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 油茶籽油多酚類物質(zhì)總酚含量的測定

1.2.5.1 制作沒食子酸的標準曲線

參照Folin-Ciocalteui 法[9-10]。

1.2.5.2 茶籽油中多酚類物質(zhì)總酚含量的測定

分別吸取50 μL 待測樣品液到10 mL 帶刻度試管中，用蒸餾水補足到6 mL，再順序加入1 mLFC 顯色劑溶液，3 mL7.5%Na2CO3溶液，在快速混勻器上迅速搖勻，室溫放置顯色2 h，在765 nm 波長下測定吸光值。由標準曲線求得對應(yīng)的酚類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，以沒食子酸計。

1.2.6 FRAP 法測定多酚類物質(zhì)的總抗氧化活性

1.2.6.1 FeSO4的標準曲線

取不同體積（0～400 μL）的1 mmol/L FeSO4溶液，用蒸餾水補足到2 mL，再加入配制好的FRAP 工作液3 mL，混勻后于37 ℃反應(yīng)30 min，在593 nm 波長下測定樣品液的吸光度，確定為還原力標準曲線。

1.2.6.2 添加抗氧化劑油茶籽油中多酚類物質(zhì)的總抗氧化活性

取不同體積的待測樣品液到刻度試管中，方法同1.2.6.1。以不加樣品組為參照，測定樣品吸光值，每個樣品平行測定3 次，取平均值。根據(jù)還原力標準曲線，計算相同吸光值的FeSO4濃度，記為FRAP。

1.2.7 油茶籽油中酚類物質(zhì)對DPPH 自由基的清除能力的測定[11]

在試管中依次加入3.0 mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液和1.0 mL 體積分數(shù)50%的乙醇，總體積為4.0 mL，混勻20 min 后，用1 cm 比色皿在517 nm 下測定，記為A0；加入3.0 mL 6.5×10-5mol/L DPPH 溶液和1.0 mL待測試樣溶液，測定值記為Ai；加入3.0 mL50%乙醇和1.0 mL 樣液，測定值記為Aj；重復測定3 次，結(jié)果取平均值。

計算DPPH 自由基清除率：清除率＝[1－（Ai－Aj）/A0]×100%。

1.2.8 油茶籽油中酚類物質(zhì)清除羥基自由基的能力[12]

在10 mL 帶刻度的試管中加入5 mL 蒸餾水、50 μL 0.02 mol/LFeSO4溶液、100 μL0.01mol/L 水楊酸溶液，最后加入50 μL0.02 mol/L 雙氧水啟動反應(yīng)，放置在37 ℃水浴鍋保溫反應(yīng)30 min，之后立即在510 nm 波長下測定吸光值，作為空白吸光值。同上，在刻度管中分別加入不同體積的待測樣品液后，再加入50 μL 0.02 mol/L 雙氧水啟動反應(yīng)，37 ℃水浴恒溫30 min 之后測定吸光值，每個樣品平行測定3 次，取平均值，作為添加樣品后的吸光值。由下式得出對羥基自由基的清除率。

式中：A1為加入待測樣品后的吸光值；A0為空白對照的吸光值。

1.2.9 油茶籽油中酚類物質(zhì)清除超氧陰離子自由基的能力[13]

加入樣品前：將pH8.2Tris-HCl 緩沖液和50 mmol/L鄰苯三酚溶液在25 ℃恒溫水浴鍋中保溫。取5 mL pH8.2Tris-HCl 緩沖液，加入50 μL50 mmol/L 鄰苯三酚溶液，在混勻器上搖勻，在325 nm 波長下立即測定。以pH8.2 Tris-HCl 緩沖液為空白，每隔0.5 min 測定依次吸光值，計算出平均值A(chǔ)0。

加入樣品后：取5 mLpH8.2Tris-HCl 緩沖液，加入待測樣品液50 μL～250 μL、50 μL50 mmol/L 鄰苯三酚溶液，在混勻器上搖勻，立即同上測定。以pH8.2Tris-HCl 緩沖液為空白，每個0.5 min 測定一次吸光值，計算出平均值A(chǔ)1。由以下式得出對超氧陰離子自由基的抑制率。

式中：A1為加入待測樣品后的吸光值；A0為空白對照的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行制圖；用統(tǒng)計分析軟件SPSS12 對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚對油茶籽油酸值影響

茶多酚對油茶籽油酸值影響見圖1。

由圖1 可知，油茶籽油的酸值隨著貯藏時間的推移在一定時間后逐漸增加，添加茶多酚后油茶籽油的酸值比空白組大，且隨著茶多酚添加量的增加，酸值增加的速度增大。添加TBHQ 組的酸值比空白組小。在（62±2）℃的貯藏溫度下，貯藏第6 天，空白酸值為1.965 mg/g，茶多酚添加質(zhì)量濃度為0.04 %組的為2.147 mg/g，比空白的酸值高0.282 mg/g，說明茶多酚不能減緩油茶籽油在（62±2）℃貯藏溫度下的酸值變化。添加TBHQ 的油茶籽油在貯藏時間內(nèi)，酸值變化很小，在貯藏第六天其酸值為1.731 mg/g，比空白組低0.234 mg/g，比0.04%TP 的低0.416 mg/g，茶多酚在抑制油茶籽油的酸值變化方面不如TBHQ。

圖1 茶多酚對茶籽油貯藏過程中酸值影響Fig.1 The effect of TP on the acid value of camellia seed oil storaged

2.2 茶多酚對油茶籽油過氧化值的影響

茶多酚對油茶籽油過氧化值的影響見圖2。

圖2 茶多酚對茶籽油貯藏中過氧化值的影響Fig.2 The effect of TP on the changes of POV of camellia seed oil storaged

由圖2 可知，添加茶多酚的油茶籽油的氧化抑制作用極顯著比TBHQ 強（P＜0.01）。第7 天空白組的POV為82.643 meq/kg，添加質(zhì)量濃度為0.02 %、0.03 %、0.04%TP 組為76.185、76.438、76.407、空白組的POV比茶多酚組高6.458、6.205 和6.236 meq/kg。比TBHQ組高4.734 meq/kg?？寡趸瘎τ筒枳延偷倪^氧化值的抑制作用大小比較為：0.02 %組＞0.04%組＞0.03 %組＞TBHQ 組。說明添加茶多酚能夠抑制油茶籽油的過氧化值增大。

2.3 油茶籽油中酚類物質(zhì)總含量

油茶籽油中酚類物質(zhì)提取量見表1。

由表1 可知，油茶籽油中酚類物質(zhì)的含量在貯藏前較高，在高溫貯藏后，酚類物質(zhì)明顯降低。即降低量為：空白組＞TBHQ 組＞0.04%TP＞0.03%TP＞0.02%TP。說明，油茶籽油在貯藏期間抗氧化的酚類物質(zhì)來源于兩部分：油茶籽油中原有的酚類物質(zhì)和添加的抗氧化劑中的酚類物質(zhì)，且在抗氧化過程中，隨著添加茶多酚的濃度的增加，損失率反而增大。

表1 油茶籽油中酚類物質(zhì)提取量Table 1 The content of phenol extracted from camellia seed oil

2.4 添加不同抗氧化劑中多酚類物質(zhì)總抗氧化的能力

通過FRAP 法，測得的多酚類物質(zhì)總抗氧化能力見圖3。

圖3 茶多酚對油花籽油多酚類物質(zhì)總抗氧化能力Fig.3 TP towards the total antioxidant capacity of polyphenol materials of camellia seed oil

隨著油茶籽油樣品中多酚類物質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，其總抗氧化能力增強，多酚類濃度最高時，添加抗氧化劑空白、0.02%TP、0.03 %TP、0.04 %TP、TPHQ 油茶油油中總酚抗氧化能力分別為是289.103、253.462、359.615、409.615、503.718 μmol/L，TBHQ 的油茶籽油中多酚抗氧化能力最強，其次為0.04%TP，最差為0.02%TP。

2.5 茶多酚對油茶籽油中多酚類物質(zhì)DPPH 清除率

茶多酚對油茶籽油中多酚類物質(zhì)DPPH 清除能力見圖4。

如圖4 所示：烘后的清除率明顯高于烘前的清除率，不添加抗氧化劑的油茶籽油中酚類物質(zhì)對DPPH自由基清除率明顯小于添加抗氧化劑的，同濃度的茶多酚處理的油茶籽油的DPPH 自由基清除率變化顯著不同（P＜0.05）?？瞻捉M的清除率增長量為1.89%，0.02%TP、0.03 % TP、0.04 %TP 和TBHQ 的增長量分別為9.02%、10.08%、8.46%、2.8%。茶多酚處理的油茶籽油的DPPH 值大于TBHQ 組。這可能是在高溫下，添加抗氧化劑的油茶籽油中的酚類物質(zhì)含量升高，產(chǎn)生自由基的數(shù)量增多，清除DPPH 自由基的能力增強，故烘后油茶籽油的DPPH 清除率升高。

圖4 茶多酚對油茶籽油中總酚清除DPPH 的能力Fig.4 TP towards DPPH radical scavenging capacity of the total phenol of camellia seed oil

2.6 油茶籽油中酚類物質(zhì)清除羥基自由基的能力

油茶籽油中酚類物質(zhì)清除羥基自由基的能力如圖5 所示。

圖5 茶多酚對油茶籽油中總酚清除OH－自由基的能力Fig.5 TP towards OH－radical scavenging capacity of the total phenol of camellia seed oil

隨著酚類物質(zhì)量的增大，其對羥基自由基的清除作用增強。在添加不同的量的抗氧化劑的實驗組中，添加抗氧化劑比不添加抗氧化劑的清除率高，添加TBHQ 的清除率不如添加茶多酚的高。清除率比較為：0.02%組＞0.04%組＞0.03%組＞TBHQ 組＞空白組。在高溫中，油茶籽油的氧化速度加快，產(chǎn)生·OH 的速度加快，單位時間油中產(chǎn)生的量增多，故出現(xiàn)油茶籽油中的清除羥基自由基的清除能力烘后比烘前高的現(xiàn)象。

2.7 油茶籽油中酚類物質(zhì)清除超氧陰離子自由基的能力

油茶籽油中酚類物質(zhì)清除超氧陰離子自由基的能力如圖6 所示。

添加茶多酚的油茶籽油中貯藏后多酚類物質(zhì)對超氧陰離子自由基的清除能力在一定范圍內(nèi)隨著酚類物質(zhì)的量的增加而增加。當添加的酚類物質(zhì)體積在40 μL 時，高溫貯藏后，空白組的抑制率為31.674%，0.02 %、0.03 %、0.04 %和TBHQ 組的抑制率分別為50.654%、15.894%、10.119%和25.980%。以0.04%TP處理組為最低，0.02%TP 處理組最高。一定濃度的TP處理，對清除超氧陰離子自由基有協(xié)同增效的作用。

圖6 茶多酚對油茶籽油中酚類清除超氧陰離子的能力Fig.6 TP towards O2-·radical scavenging capacity of the total phenol of camellia seed oil

3 結(jié)論

油茶籽油的儲藏穩(wěn)定性受多種因素的影響。通過添加不同質(zhì)量的茶多酚配制成質(zhì)量濃度為0.02 %、0.03%、0.04%的油茶籽油，與添加質(zhì)量濃度為0.02%的TBHQ 一起與空白組對照，放置在（62±2）℃的貯藏溫度下，并比較貯藏后油中酚類物質(zhì)的含量以及酚類物質(zhì)清除自由基的效率，茶多酚對油茶籽油的酸值抑制作用不如TBHQ 的，且隨著茶多酚添加量的逐漸增加，添加TBHQ 的油茶籽油的酸值變化較小，其酸值在貯藏期間一直小于不添加任何抗氧化劑的。茶多酚對油茶籽油的過氧化值的抑制作用比TBHQ 的強，其抑制作用比較為：0.02%TP＞0.04%TP ＞0.03%TP。

油茶籽油中固有的酚類物具有一定的抗氧化作用。在添加抗氧化劑的油茶籽油中，帶入的抗氧化劑中抗氧化物質(zhì)和油脂中原有的酚類物質(zhì)具有相互作用的關(guān)系。添加TBHQ 的抗氧化效果不及茶多酚的。對羥基自由基、超氧陰離子、DPPH 的清除率，以添加茶多酚0.02%的油茶籽油抗氧化效果最好。

茶多酚是一種天然的抗氧化劑，其對人體的毒性較TBHQ 小，且其在價格方面較其他的天然抗氧化劑低。綜合評價，茶多酚對油茶籽油的貯藏性能較好。

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