利用質譜分析法從酶譜鑒定嗜熱真菌木聚糖酶

吳亞寧，劉剛，余少文，李水明，王娟，*

（1.深圳大學生命科學學院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳 518060；2.深圳大學生命科學學院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東深圳 518060）

嗜熱真菌是一類最低生長溫度為20 ℃或20 ℃以上，最高生長溫度為50 ℃或50 ℃以上的特殊真菌類群[1-2]。因其極端的生長環(huán)境，其內部蘊含大量的耐高溫降解酶系，是耐高溫酶的主要來源。因此，從分離的嗜熱真菌中鑒定耐高溫的木質纖維素降解酶、克隆相關基因，在可再生生物資源的有效利用方面具有重要社會和經濟意義。

隨著生物質譜技術的快速發(fā)展，質譜分析為蛋白質的鑒定提供了重要的技術保障，使蛋白質的鑒定更加快速化、準確化和靈敏化，從而可以在蛋白質水平上得到更多的基因表達信息，這對促進生命科學的發(fā)展具有重要的意義。而蛋白酶做為蛋白質家族的重要成員，其對生命活動的調控發(fā)揮著巨大作用，所以利用質譜技術對蛋白酶的快速鑒定，無疑可加快人們對蛋白酶的開發(fā)利用。目前，質譜分析技術在酶鑒定中的應用已越來越廣泛。如孫明忠等利用激光解吸飛行時間質譜對白眉蝮蛇蛇毒酶進行了研究[3]；呂磊等利用生物質譜對耐藥相關果糖二磷酸醛縮酶C 進行了分析與鑒定[4]；黃河清等利用基質輔助激光解吸/電離質譜法對海兔卵多肽內切酶的組成、結構與功能進行了研究[5]；Peterson 等使用質譜分析法鑒定了真菌的甘露聚糖酶[6]。

木聚糖酶是一類可以將木聚糖降解成低聚木糖或木糖的復合酶系，廣泛應用于造紙、食品、飼料等行業(yè)。本文利用質譜技術對嗜熱踝節(jié)菌中誘導與非誘導酶譜差異條帶進行分析，成功鑒定到一個糖苷第11 家族的內切木聚糖酶TtXynA，并通過TAIL-PCR 擴增獲得其全長序列，該基因是從嗜熱踝節(jié)菌中克隆到的第一個木聚糖酶基因。

1 材料與方法

1.1 菌株的培養(yǎng)

1.1.1 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L～20 g/L。

液體種子培養(yǎng)基：Mandels 營養(yǎng)鹽濃縮液100 mL/L，Mandels 微量元素濃縮1.0 mL/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L 的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫80 1.5 mL/L。

木聚糖酶誘導培養(yǎng)基：玉米芯粉30 g/L，Mandels 營養(yǎng)鹽濃縮液200mL/L，Mandels 微量元素濃縮液1.0mL/L，葡萄糖3 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L 的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫80 1.5 mL/L。

非誘導培養(yǎng)基：Mandels 營養(yǎng)鹽濃縮液200 mL/L，Mandels 微量元素濃縮液1.0 mL/L，葡萄糖3 g/L，蛋白胨1 g/L，1 mol/L 的檸檬酸緩沖液（pH4.5）50 mL/L，吐溫80 1.5 mL/L。

1.1.2 誘導及非誘導培養(yǎng)

將純化菌株在PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 左右，然后用無菌水洗孢子，取3 mL 接種于含有30 mL 液體種子培養(yǎng)基的三角搖瓶中，于50 ℃，250 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)3 d～4 d 后，各取3 mL 液體種子分別接種到含有30 mL 木聚糖酶誘導培養(yǎng)基及非誘導培養(yǎng)基的三角搖瓶中，于50 ℃，250 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)4 d 后，分別取其發(fā)酵液于12 000 r/min 離心5 min，取上清液進行木聚糖酶酶活測定[7]。

1.2 木聚糖酶酶活測定

木聚糖酶酶活測定參照Bailey 等的方法[8]進行。木聚糖酶活力的測定方法是根據(jù)木聚糖酶可將木聚糖水解成木糖的原理?；盍挝徊捎脟H單位，定義為在水解反應中每分鐘形成1 μmol 的還原糖量（以木糖計）所需要的酶量為一個活力單位（IU）。具體步驟如下：在25 mL 刻度反應管中加入1.8 mL 2%的木聚糖（使用0.05 mol/L，pH5.5 的檸檬酸鈉緩沖液配制），50 ℃預熱5 min，然后加入0.2 mL 適當稀釋的發(fā)酵液上清，于復式恒溫水?。?0 ℃）中振蕩5 min；取出反應管，迅速加入3 mL DNS 試劑，沸水浴15 min；流水冷卻后，在540 nm 下測定吸光值；根據(jù)木糖標準曲線計算出酶反應過程所釋放的木糖量?？瞻讓φ战M：在25mL 刻度反應管中加入1.8 mL 2 %的木聚糖，50 ℃預熱5 min，加入3 mL DNS 試劑，加入0.2 mL 適當稀釋的發(fā)酵液上清迅速沸水浴15 min，流水冷卻后，在540 nm下調零。

1.3 非變性膠的配制及電泳

非變性膠5×Loading Buffer（不含SDS 及β—疏基乙醇）為250 mmol/LTris-HCl（pH 6.8）、0.5%（g/mL）溴酚蘭和50%（體積比）甘油。非變性膠電泳緩沖液為不含SDS 的1×Tris-Glycine Buffer（0.025 mol/L Tris，0.25 mol/L Glycine）。

配12%的非變性膠（不加SDS，其它組份不變），在膠板上將最左側的泳道標為1，與1 相鄰的泳道標記為2，其余泳道不標記。[將誘導及非誘導的上清與非變性膠5×Loading Buffer 進行1 ∶4（體積比）的混合]（不加熱）后上樣，第1 泳道加樣孔上非誘導的上清，第2 及其余泳道均為誘導上清，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳過程在冰上進行，保持低溫，以免蛋白變性。電泳結束后，將第1 和第2 泳道連在一起切下進行快速考染（用微波爐加熱煮沸2 次～3 次后，染色10 min～20 min）和快速脫色（脫色10 min～20 min），剩余膠塊用保鮮膜包好后置于4 ℃冰箱內保存。

快速脫色后，將其與原來未染色的膠塊放在一起，拼成一塊完整的膠。以第1 泳道為對照，在未染色的膠塊中將第2 泳道和第1 泳道顯著不同的條帶對應的膠塊切下，置于1.5 mL 的EP 管中并加入適量的檸檬酸鈉緩沖液（pH5.5），用小研棒將膠塊細細研磨。離心取上清，測木聚糖酶酶活。

1.4 SDS-PAGE

配制15%的變性膠，在膠板上取3 個相鄰的泳道分別標記為1、2、3，第1 泳道為非誘導上清，第2 泳道為誘導上清，第3 泳道為切膠回收后有酶活的上清。上樣后，進行SDS-PAGE，常規(guī)染色及脫色。

1.5 切膠

將200 μL 槍頭在約1cm 處剪斷，在剪斷的槍頭內吸少量超純水（易于將切下的蛋白膠粒打出），將所需蛋白質點用已剪斷的槍頭切下，并放入裝有100 μL超純水的小PCR 管中。在溫控板上25 ℃振蕩并進行水洗、平衡、脫色、平衡。

1.6 質譜分析

參照Li 等[9]已報道的膠內酶切法進行預處理，利用質譜儀（Bruker Daltonios）對得到的肽段進行MALDI-TOF 質譜鑒定。得到蛋白樣品的肽質量指紋圖，通過本地化的MASCOT 軟件（Version 2.2，Matrix Science）在數(shù)據(jù)庫[NCBInr 20120922]中進行蛋白質檢索。設定參數(shù)為：Max Missed Cleavages：1；Fixed Modifications；Carboxymethyl（C）；Variable Modifications：Oxidation（M）；Mass values：MH+、Monoisotopic；Peptide Mass Tolerance：±0.2Da。若鑒定結果得分大于83分（P＜0.05），說明搜庫結果可信。

1.7 同源片段的克隆

根據(jù)質譜分析的肽段序列設計簡并引物PF：5'-TGGAAYCCNGGNYTNAAYGC -3'；PR：5' -GCCCAN GCRTCRAARTGRCANCC-3'，以嗜熱踝節(jié)菌基因組DNA 為模板進行PCR 擴增。將目的片段切膠回收，連接pMD18-T 載體測序，得出中間序列。

1.8 TAIL-PCR 克隆全長基因

利用TAIL-PCR 方法[10]分別擴增TtXynA 基因的5'末端和3'末端，TAIL-PCR 擴增過程中用到的特異性引物（Specific primer）見表1，隨機引物（Arbitrary degenerate primer，AD）參考劉自勇等的文獻[11]。TAIL-PCR 的反應體系和反應參數(shù)設置參考Takara 公司的Genome Walking Kit 說明書，即3 條特異性引物分別與7 條隨機引物進行三輪反應后，將第三輪的目的片段切膠回收，連接pMD-19-T 載體測序。根據(jù)獲得的全長序列，設計引物TtxynF 及TtxynR（表1）擴增TtXynA 基因全長。

表1 Tail-PCR 特異性引物Table 1 The specific primers of Tail-PCR

1.9 TtXynA 同源蛋白的進化分析

根據(jù)Kimura 雙參數(shù)模型用臨近相鄰法（Neighbor-Joining，NJ）構建TtXynA 及其同源蛋白的進化樹[12]。

2 結果與分析

2.1 酶譜分析

用非變性膠對粗酶液進行第一次分離純化，根據(jù)對非變性膠中酶譜的分析，可以進行切膠回收，測酶活，如果有酶活，再將有酶活的酶液進行第二次分離純化即進行SDS-PAGE，再根據(jù)對變性膠中酶譜的分析，可以確定出目的蛋白條帶。誘導及非誘導的酶譜見圖1。

圖1 嗜熱踝節(jié)菌產木聚糖酶誘導及非誘導的酶譜Fig.1 The zymogram of Talaromyces thermophilus with induced and non-induced culture

2.2 質譜分析結果

MASCOT 軟件在數(shù)據(jù)庫[NCBInr 20120922]中進行蛋白質檢索的結果表明，該蛋白與擬青霉屬Paecilomyces sp.J18 的內切木聚糖酶（GeneBank 編號：ACS26244.1）高度同源，鑒定結果得分為188 分，表明搜庫結果可信。另外，還與長枝木霉Thermomyces lanuginosus 的內切木聚糖酶（gi|335371365）具有一定同源性，鑒定結果得分為83 分。

2.3 基因全長的獲得

根據(jù)質譜分析獲得的肽段序列設計簡并引物進行PCR 擴增，獲得嗜熱踝節(jié)菌木聚糖酶基因的中間序列，利用TAIL-PCR 技術擴增該基因的5'和3'端序列。經過各三輪TAIL-PCR 擴增，得到一個900 bp 左右的5'端片段和一個500 bp 左右的3'端片段。將兩個片段進行測序，并與擬青霉木聚糖酶基因進行核苷酸序列比對，最后，將測序結果與已擴增的中間同源片段拼接，得出基因全長序列為788 bp，根據(jù)設計的上下游引物TtxynF、TtxynR，成功擴增出TtXynA 基因全長序列見圖2，其DNA 序列已提交至NCBI，登錄號為KC422245。該基因含有一個內含子，無CBM 結構域。對應的蛋白質屬于糖苷水解酶第11 家族的成員。

圖2 TtXynA 基因全長Fig.2 Full-length of TtXynA

2.4 TtXynA 及其同源蛋白的進化分析

將嗜熱踝節(jié)菌TtXynA 蛋白序列與GenBank 中數(shù)據(jù)進行比對，從中得到多種不同來源的木聚糖酶基因，與TtXynA 蛋白具有較高的序列同源性。其種類（登錄號）分別為：Paecilomyces sp.J18（ACS26244）、Thermomyces lanuginosus（AEH57194）、Trichoderma reesei（AAB29346）、Aspergillus fumigates（ADM47839）、Humicola grisea var.thermoidea（AAG16891）、Myceliophthora thermophila ATCC 42464（XP_003664784）、Chaetomium thermophilum var.thermophilum DSM 1495（EGS20234）。利用CLUSTAL X 軟件將這8 個蛋白序列匹配排列后，再利用MEGA 5.0 軟件采用NJ 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，通過進化樹分析，發(fā)現(xiàn)與嗜熱踝節(jié)菌TtXynA 蛋白序列同源性較高的是擬青霉（Paecilomyces sp.J18）木聚糖酶，與來自疏棉狀嗜熱絲孢菌、里氏木霉、煙曲霉的木聚糖酶親緣關系較近，與來自灰腐質霉高溫變種、嗜熱毀絲霉和嗜熱毛殼霉變種的木聚糖酶關系相對較遠。

圖3 根據(jù)Kimura 雙參數(shù)模型用NJ 法構建TtXynA 及其同源蛋白的進化樹Fig.3 Phylogenetic trees based on homologous TtXynA sequences using NJ method by Kimura’s two-parameter model

3 討論

我們通過前期實驗分離鑒定了具有木聚糖酶活性的嗜熱踝節(jié)菌WYN9，該菌屬于藍狀菌屬真菌，但該菌種基因組序列未知，基因庫中相關序列極少。我們曾收集藍狀菌屬及與其親緣關系較近種屬來源的11家族木聚糖酶序列信息，設計簡并引物擴增對應木聚糖酶基因序列，但未獲得任何有意義的基因片段。通過對嗜熱踝節(jié)菌產木聚糖酶誘導與非誘導酶譜的分析，發(fā)現(xiàn)誘導后出現(xiàn)的條帶清晰，對應蛋白大小與11 家族木聚糖酶大小吻合，約23 kDa 左右。結合質譜分析技術成功鑒定到一個糖苷第11 家族的內切木聚糖酶TtXynA，并通過TAIL-PCR 擴增獲得TtXynA 基因全長序列。本研究的結果表明通過質譜-酶譜方法聯(lián)合分析未知蛋白是一種快速高效的鑒定蛋白質的方法。

TtXynA 基因是從嗜熱踝節(jié)菌中克隆到的第一個木聚糖酶基因，但對應蛋白序列與擬青霉木聚糖酶100%同源，與疏棉狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus 木聚糖酶（AEH57194.1）同源性為82%，以及結合TtXynA 同源基因的進化分析，結果表明在真菌中半纖維素降解酶超蛋白家族的成員廣泛存在，并在降解過程中發(fā)揮重要作用。在蛋白酶的長期進化過程中，推測該蛋白因具有較強的木聚糖降解能力而在不同種屬的菌株中被完整的保存下來。目前，在真菌中發(fā)現(xiàn)的11 家族木聚糖酶已有多種，主要分布在木霉[14]、曲霉屬[15]、青霉屬[16]、鏈格孢屬[17]等絲狀真菌中。然而，其中具備嗜熱特性的木聚糖酶并不多，我們對嗜熱踝節(jié)菌WYN9 胞外木聚糖酶的酶學性質進行初步研究的結果表明，其胞外粗酶液于60 ℃保存30 min 后，酶活可保持原始酶活的95%以上（未發(fā)表），因此，可初步判斷TtXynA 具有耐熱的特點。有熱穩(wěn)定特性的木聚糖酶具有更廣泛的應用，在后續(xù)研究中，我們將對該基因進行異源表達、純化，進一步確認該蛋白的酶學性質、催化活性及底物降解特異性等，并在相關的領域進行應用。

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