小鼠視神經(jīng)炎視同模型的建立及評估

周歡粉，魏世輝，李曉明

特發(fā)性脫髓鞘性視神經(jīng)炎（idiopathetic demyelinated optic neuritis，IDON）是視神經(jīng)常見的一種炎性脫髓鞘性疾病，具有自限性，可導致急性視力下降。視神經(jīng)炎的病理特征主要表現(xiàn)為髓鞘脫失。實驗性自身免疫性腦脊髓炎 （experimental autoimmune encephalo-myelitis，EAE）與脫髓鞘性視神經(jīng)炎相比，在視覺誘發(fā)電位（visual evoked potentials，VEP）、磁共振成像和病理方面極其相似，并且EAE中VEP的潛伏期延長，類似多發(fā)性硬化 （mlltiple sclerosis，MS）和視神經(jīng)炎（optic neuritis，ON）[1，2]。 目前，國際上普遍應用EAE模型來研究MS和ON，但制作模型的方法多種多樣。本研究首次在國內(nèi)建立MOG35－55多肽誘發(fā)的ON小鼠模型，為下一步廣泛開展IDON發(fā)病機制和治療的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 實驗用C57BL/6（H-2b）小鼠50只，雌雄不限，8~10周齡，由中國人民解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)于室溫24℃的環(huán)境中，維持光/暗12 h循環(huán)交替，并給予充足的食料和潔凈飲水。飼養(yǎng)2~7 d，用于實驗。

1.1.2 主要試劑 鼠源 MOG35－55多肽 （MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK）：北京賽百盛基因技術有限公司合成，采用反高校液相色譜儀（C18柱）分離純化，純度在95%以上；完全弗氏佐劑（CFA）購自美國Sigma公司；百日咳菌苗和結(jié)核桿菌凍干粉均購自北京天壇生物制品研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 50只C57BL/6小鼠隨機分為2組：對照組10只、EAE模型組40只。全部實驗小鼠取右眼為實驗對象。

1.2.2 實驗性視神經(jīng)炎小鼠模型的建立及神經(jīng)功能評分 將 300 μg MOG35-55溶于 200 μl PBS液，再與200 μl CFA混合，添加結(jié)合桿菌使其終濃度為2 mg/ml，用電子攪拌棒冰浴下攪拌5~10 min達到充分乳化（判斷方法：將1滴乳劑滴入水中，如不散開漂在水面則為乳化完全；如立即散開，則未乳化充分）。以上操作盡量在避光、低溫、無菌條件下進行。EAE模型組雙側(cè)腹壁分四點皮下注射混合乳劑，對照組直接將 200 μl PBS液和 200 μl CFA充分乳化后分雙側(cè)腹壁分4個點皮下注射。兩組均于免疫前24 h和免疫后24 h每只小鼠腹腔注射100 μl百日咳菌液（含活菌 2×109個）。 每天由觀察者記錄每只小鼠的體重并進行神經(jīng)功能評分，直至免疫后的30 d。

神經(jīng)功能評分標準：0分：無臨床癥狀；1分：尾部張力降低或輕度步態(tài)笨拙；2分：尾部無張力或中度步態(tài)異常，雙后肢無力,被動翻身后可以恢復；3分：雙后肢癱瘓,被動翻身后不能恢復,但給予刺激后可以挪動；4分：雙后肢癱瘓,前肢癱瘓或肌力減弱伴尿便失禁；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。

1.2.3 光鏡下病理形態(tài)學 在免疫后第7、14、20、30天，對照組取2只小鼠、EAE模型組10只小鼠用4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注，鈍性分類視神經(jīng)，暴露視交叉，在視交叉處及球后0.5 mm處剪斷視神經(jīng)。對視神經(jīng)采用HE染色、LFB髓鞘染色和Bielschowsky軸突銀染，分別評估炎性細胞浸潤、髓鞘脫失和軸突的病理改變。

1.2.4 電鏡超微結(jié)構的觀察 對照組和EAE模型組分別于免疫后第7、14、20、30天做完電生理檢查后，各隨機選取1只眼，1%戊苯巴比妥0.15 ml/只腹腔麻醉后，取出視神經(jīng)，用于透射電鏡的觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗后，對各獨立樣本的均數(shù)進行t檢驗。以P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié) 果

2.1 MOG35－55免疫小鼠模型建立、體重變化和神經(jīng)功能評分 本實驗用C57BL/6小鼠，以MOG35-55多肽為抗原制備MS和ON的動物模型，該模型為慢性進行型MS的模型。除在免疫后的第7天處死的10只小鼠外，其余EAE模型組30只小鼠全部發(fā)病，免疫后第2天起及隨后的1周時間內(nèi)小鼠體重輕度下降，此間沒有出現(xiàn)運動功能障礙,評分均為0分；實驗小鼠在免疫后的第10天陸續(xù)發(fā)病，平均發(fā)病時間為（14.1±1.48）d。第20天時，小鼠的平均臨床評分達到高峰。以后小鼠的臨床癥狀有輕微的降低，但是維持在一個較高的水平?；疾⌒∈蟊憩F(xiàn)為精神萎靡、體重下降、尾無力、松弛、下垂，后肢或四肢麻痹、大小便失禁，個別小鼠表現(xiàn)為共濟失調(diào)。對照組無一發(fā)病。

2.2 視神經(jīng)組織形態(tài)學的改變

2.2.1 光鏡觀察 EAE模型組用于研究發(fā)病率的20只小鼠（40眼）其中有23眼視神經(jīng) LFB染色示不同程度的脫髓鞘改變（雌性小鼠12眼，雄性小鼠11眼，兩組無明顯差異）。對照組小鼠視神經(jīng)縱切面HE染色可見神經(jīng)纖維排列整齊，染色均勻，無炎性細胞浸潤。LFB染色見髓鞘被染成均勻的藍色，排列致密整齊。視神經(jīng)橫切面Bielsehowsky軸突銀染顯示軸突被染成黑色，背景呈黃棕色。CON小鼠直至免疫后的第30天視神經(jīng)病理未發(fā)生明顯改變。EAE模型組在免疫后的第7天，小鼠視神經(jīng)HE染色和 Bielsehowsky軸突銀染與對照組對比均無明顯改變；LFB染色可見髓鞘排列紊亂，失去明顯條索結(jié)構，但無髓鞘脫失。在免疫后的第14天，視神經(jīng)縱切面 HE染色見中度炎性細胞浸潤。LFB染色示病灶處不規(guī)則片狀髓鞘脫失，髓鞘脫失嚴重，邊界欠清晰。Bielsehowsky軸突銀染可見視神經(jīng)軸突組織溶解，軸突疏松減少。在免疫后的第20天，EAE模型組視神經(jīng)HE染色和免疫后的第14天無明顯區(qū)別，LFB染色可見大范圍髓鞘脫失，邊界清晰。Bielsehowsky軸突銀染可見視神經(jīng)軸突結(jié)構紊亂，疏松減少，空泡化明顯。在免疫后的第30天，視神經(jīng)HE染色炎性細胞數(shù)目相對減少，LFB染色可見脫失的再生薄層髓鞘，染色較淺。Bielsehowsky軸突銀染仍可見嚴重的軸突組織溶解減少，間質(zhì)空泡化。

2.2.2 視神經(jīng)超微結(jié)構的改變 在透射電鏡下分別觀察對照組組、EAE模型組在免疫后的第7、14、20、30天各1只VEP改變眼的視神經(jīng)超微結(jié)構。電鏡所見：對照組C57BL/6小鼠視神經(jīng)超微結(jié)構（圖1A）：正常視神經(jīng)纖維較細，神經(jīng)軸索為排列整齊的板層髓鞘所包繞,髓鞘完整、密度均勻;軸索內(nèi)可見大量的微絲及呈長橢圓形的少量線粒體。免疫后的第7天大部分有髓纖維結(jié)構正常，髓鞘呈板層狀排列，包裹中央的軸突，軸索完整，細胞器正常；少數(shù)髓鞘層狀結(jié)構排列疏松或斷裂，與軸突間有間隙形成，線粒體輕度水腫（圖1B）。免疫后的第14天，髓鞘分層明顯，呈洋蔥皮樣改變，軸突軸膜與髓鞘間有間隙形成，可見不同程度的髓鞘板層狀分離、變薄、脫失。軸索水腫，電子密度低，個別軸索內(nèi)線粒體明顯腫脹，嵴短而少或溶解（圖1C）。免疫后的第20天，脫髓鞘的神經(jīng)纖維增多，軸突與髓鞘間間隙增大，軸索內(nèi)微絲溶解較明顯而呈空泡狀，微管消失（圖1D）。免疫后的第7天，軸突變性、水腫逐漸減輕，軸索周圍髓鞘脫失出現(xiàn)重建的薄層髓鞘，表明少突膠質(zhì)前體細胞遷移到脫髓鞘區(qū)進行髓鞘重建（圖 1E）。

3 討 論

視神經(jīng)炎的動物模型主要包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）髓鞘抗原免疫誘導的EAE 模型[3]、病毒誘導的脫髓鞘模型[4，5]和抗體誘導的脫髓鞘模型[6]。由于EAE模型與人類特發(fā)性脫髓鞘性視神經(jīng)炎在病理、MRI和VEP方面有許多相似之處，常用來作為MS和ON的實驗模型。當前，國內(nèi)外主要通過髓鞘蛋白誘發(fā)建立EAE模型，即髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白 （MOG）、髓鞘堿性蛋白（MBP）和髓鞘蛋白脂蛋白（PLP）。由于MOG存在于髓鞘膜和少突膠質(zhì)細胞的最外層,具有高度免疫原性，在視神經(jīng)髓鞘上的含量比CNS和脊髓都要多，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)唯有針對MOG的抗體能夠在體內(nèi)和體外造成脫髓鞘[7，8]，許多證據(jù)證明MOG和抗MOG抗體在ON的發(fā)病過程中起重要作用。人工合成的MOG35－55多肽片段代表其免疫顯性區(qū)域[9]，用于視神經(jīng)炎小鼠模型的建立，效果更明顯。此研究就是用MOG35－55多肽作為唯一的免疫原。

本實驗用MOG35－55誘發(fā)C57BL/6小鼠制備的EAE模型，具有慢性進行性特點。EAE實驗組小鼠突出表現(xiàn)為活動性降低、進食減少、體重減輕和皮毛不光滑。同時，小鼠出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)系統(tǒng)體征：以尾無力下垂、雙后肢癱瘓多見，四肢癱瘓或單肢癱瘓的較少。在此基礎上，筆者進行了病理分析：EAE組用于研究發(fā)病率的20只小鼠（40眼）其中有23眼視神經(jīng)LFB染色示不同程度的脫髓鞘改變，VEP檢查結(jié)果發(fā)生明顯改變時處死小鼠，取5個不同切面視神經(jīng)進行LFB染色，筆者以此抗原建立的視神經(jīng)炎小鼠模型以眼計算發(fā)病率為57.5%（病理診斷）。一方面，Sbao等[9]應用MOG多肽誘導C57BL/6小鼠的發(fā)病率為70%，比筆者建立的視神經(jīng)炎模型發(fā)病率略高，經(jīng)分析筆者認為這主要與抗原的純度以及百日咳菌素的活性有關，造成的發(fā)病率差異不會對實驗模型的建立產(chǎn)生實質(zhì)影響。另一方面，Bettelli等[1]在MOG－TCR特異的轉(zhuǎn)基因小鼠成功建立單癥狀的視神經(jīng)炎模型，雖然無腦部和脊髓的脫髓鞘改變，比較方便研究視神經(jīng)炎，但費用昂貴，難于大范圍開展普及研究。而使用MOG35-55多肽誘導C57BL/6小鼠誘發(fā)的EAE模型，也是一類國際上公認、較成熟的、較理想的EAE模型。國內(nèi)雖然早已用此模型用于研究MS，但尚無建立此模型用于視神經(jīng)炎的研究。目前國內(nèi)對視神經(jīng)的臨床研究報道越來越多，但病因機制的基礎研究較少。筆者建立的小鼠模型易復制，發(fā)病率高，經(jīng)濟適用，而且普及應用的前景比較樂觀，便于對ON以及ON與MS的關系進行系統(tǒng)深入的研究。這和筆者的研究初衷是一致的。

在實驗過程中，筆者發(fā)現(xiàn)：在不同的時間點，視神經(jīng)脫髓鞘后的病理變化不盡相同，這主要與本文模型的病理改變呈現(xiàn)節(jié)段性和局灶性，以及各動物的發(fā)病情況各不相同有關。同時，在光鏡下，還發(fā)現(xiàn)：在免疫后的第7天，LFB染色可見髓鞘排列紊亂，但無明顯脫髓鞘表現(xiàn)，電鏡下觀察到髓鞘斷裂分層，與軸突分離，可見輕度的線粒體腫脹。這個問題，已有文獻給予過報道，即以MOG或MOG特異T細胞免疫C57BL/6小鼠的視神經(jīng)病變主要為炎癥反應和髓鞘脫失[1]，這與筆者這次小鼠模型的建立取得的研究結(jié)果是一致的。本實驗中觀察到EAE組小鼠視神經(jīng)呈現(xiàn)不同程度的髓鞘脫失和軸索的損害，很可能是視神經(jīng)炎視力下降的病理基礎，需要進行更深一步的研究。綜上所述，筆者這次視神經(jīng)炎小鼠模型，初步模擬了脫髓鞘性視神經(jīng)炎的發(fā)生和發(fā)展過程，各項指標也基本符合建模標準和有關要求。

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