滇黃精黃酮提取工藝及活性的初步研究

陳毅堅，石 雪，屈 睿，彭文書

(云南民族大學化學與生物技術(shù)學院，國家民委－教育部共建民族藥資源化學重點實驗室，云南昆明 650500)

滇黃精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl)，為百合科黃精屬植物，又名老虎姜、雞頭參。主產(chǎn)于云南、四川、貴州、廣西等省，生長在海拔 2000～3900m的陰濕林地和灌木叢中［1］。滇黃精是我國的一味傳統(tǒng)中藥，具有抗病原微生物、降血糖、抗疲勞、抗氧化、延緩衰老、止血、抗病毒等作用［2－3］。臨床上常用于治虛損寒熱，肺癆咳血，病后體虛食少，筋骨軟弱，風濕疼痛，風癩癬疾等［4－5］。經(jīng)研究表明:滇黃精主要含有多糖、黃精低聚糖、黃精皂甙、氨基酸、黃酮、蒽醌等活性成分［6－7］。其中國內(nèi)外科研人員對黃精多糖開展了大量研究，不僅對黃精多糖分類鑒定做了大量工作，還對其化學結(jié)構(gòu)及藥理進行了分析評價，對黃精多糖的研究已經(jīng)比較透徹。但對黃精中的黃酮類化合物的研究甚少，而黃酮類化合物具有較強的清除自由基和抗氧化活性［8－9］，有抗癌、抗病毒、抗發(fā)炎、抗過敏以及保護心腦血管等功能，因此有必要對滇黃精中的黃酮類物質(zhì)開展研究。鑒于此，本文將對滇黃精黃酮的提取工藝及體外清除率、抗氧化性能進行實驗研究。為該藥材活性機理的探討及所含黃酮的開發(fā)利用提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滇黃精于2011年采集于云南省普洱市寶藏鄉(xiāng)，標本經(jīng)鑒定后保存于云南民族大學化學與生物技術(shù)實驗室。取滇黃精植株根莖于50℃恒溫干燥箱干燥后粉碎并過80目篩，保存?zhèn)溆?。蘆丁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鋁、乙醇、蒽酮、硫酸、DPPH等試劑均為分析純;溶劑為去離子水。

電子天平 梅特勒;7200型可見分光光度計尤尼柯;移液器 Eppendorf。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精總黃酮的測定 硝酸鋁－亞硝酸鈉法［10－11］:分別準確吸取 0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00mL 500μg/mL的蘆丁標準儲備液置于25mL的容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0mL搖勻，放置6min后，加10%的Al(NO3)3溶液1.0mL搖勻，放置6min，加4%NaOH溶液10.0mL，用60%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，放置15min后，溶液呈橙紅色。以加0.00mL蘆丁標準液為空白分別測定上述標準溶液在波長510nm處的吸光度，繪制標準曲線(如圖1)，得線性回歸方程和相關(guān)參數(shù)，方程為 Y=0.48696X－0.01043，R=0.99955。

圖1 蘆丁標準曲Fig.1 The standarde curve of rutin

1.2.2 滇黃精總黃酮的提取工藝

1.2.2.1 滇黃精黃酮提取的單因素設(shè)計［12］準確稱取1.00g滇黃精粉末，用乙醇作為溶劑，采用超聲波輔助提取滇黃精總黃酮。用硝酸鋁－亞硝酸鈉法測定滇黃精總黃酮含量。在超聲波溫度為20℃、超聲功率為500W的前提下分別考察乙醇濃度、液料比、超聲波時間、提取次數(shù)對滇黃精總黃酮提取的影響。M1、M2、Mn分別為每次提取得黃酮總質(zhì)量，M樣品為所取樣品的質(zhì)量。

1.2.2.2 滇黃精總黃酮提取的正交實驗設(shè)計［13］在單因素實驗的基礎(chǔ)上，分別準確稱取1.00g滇黃精粉末9份，在超聲波溫度為20℃條件下對滇黃精總黃酮提取因素乙醇濃度、液料比、超聲波時間、提取次數(shù)進行L9(34)正交實驗，正交實驗設(shè)計表見表1。

1.2.2.3 滇黃精總黃酮最佳提取條件驗證實驗 用分析天平精密稱取5.000g滇黃精三份，采用以上正交實驗中優(yōu)化所得最佳提取條件對滇黃精黃酮進行提取，并與正交實驗中最佳提取條件下的提取率進行對比分析。

1.2.3 滇黃精總黃酮清除DPPH自由基作用的測定［14－15］精確稱取 0.0040g 的 DPPH，用 95% 的乙醇溶解并定容至50mL。取2mL不同濃度的待測液移入比色管中，比色管中分別加入2mL DPPH溶液。搖勻后室溫靜置20min，于517nm處測定吸光度A樣品(以2mL 95%乙醇溶液替代樣品作空白測得A空白)，以同濃度的蘆丁作為對照。根據(jù)下列公式計算。

1.2.4 滇黃精黃酮還原力的測定［16－18］將2.5mL不同濃度的待測液分別與2.5mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)及2.5mL鐵氰化鉀(1%)混勻，混合物在50℃水浴中靜置 20min，然后加入 2.5mL的 TCA(10%)終止反應(yīng)，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入 2.5mL無水乙醇和0.5mL FeC13(0.1%)，混勻后靜置10min在700nm處測定吸光度(以蒸餾水代替樣品的混合液作參比溶液)，以同濃度的蘆丁作為對照，吸光度越大還原力越強。

表1 滇黃精總黃酮提取條件正交實驗因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal design on flavonoid extraction

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對滇黃精總黃酮提取的影響

由圖2可知，當?shù)狳S精在超聲波溫度為20℃，液料比為15∶1、超聲波時間為60min、提取次數(shù)為1次，乙醇濃度小于80%時，滇黃精總黃酮提取率隨乙醇濃度的增加而呈緩慢的上升趨勢;當乙醇濃度高于80%后，滇黃精總黃酮提取率隨乙醇濃度的增加呈急劇下降的趨勢。這就表明:滇黃精總黃酮的最佳乙醇提取濃度在70%～80%之間。

圖2 乙醇濃度對滇黃精總黃酮提取的影響Fig.2 The influence of alcohol concentration on flavonoid extraction

2.2 液料比對滇黃精總黃酮提取率的影響

由圖3可知，滇黃精在超聲溫度為20℃、乙醇濃度為80%、超聲波時間為60min、提取次數(shù)為1次，液料比小于15∶1時，滇黃精黃酮提取率隨液料比倍數(shù)的增加而呈急劇上升的趨勢;當液料比超過15∶1時，滇黃精總黃酮提取率隨液料比的增加趨于穩(wěn)定的趨勢。這就表明:當液料比達到15∶1以后，液料比對滇黃精總黃酮提取率基本已經(jīng)沒有影響。所以滇黃精總黃酮提取的液料比應(yīng)該選擇15∶1以上。

2.3 超聲波時間對滇黃精總黃酮提取率的影響

由圖4可知，滇黃精在超聲波溫度為20℃、乙醇濃度為80%、液料比為15∶1、提取次數(shù)為1次、超聲波時間小于60min時，滇黃精總黃酮提取率隨超聲波時間的增加而呈上升趨勢;當超聲波時間超過60min時，超聲波時間對滇黃精總黃酮提取率已經(jīng)沒有明顯的影響。由此可知，滇黃精總黃酮的最佳超聲波時間應(yīng)該在60min。

圖3 液料比對滇黃精總黃酮提取的影響Fig.3 The influence of liquid/solid on flavonoid extraction

圖4 超聲波時間對滇黃精總黃酮提取率的影響Fig.4 The influence of ultrasonic wave extracting time on flavonoid extraction

2.4 提取次數(shù)對滇黃精總黃酮提取率的影響

由圖5可知，滇黃精在超聲波溫度為20℃、乙醇濃度為80%、液料比為15∶1、超聲波時間為60min、提取次數(shù)小于3次時，滇黃精總黃酮提取率隨提取次數(shù)的增加呈緩慢的上升趨勢;當提取次數(shù)超過3次時，提取次數(shù)對滇黃精總黃酮提取率已經(jīng)沒有明顯的影響。由此可知，滇黃精總黃酮的最佳提取次數(shù)為3次。

圖5 提取次數(shù)對滇黃精總黃酮提取率的影響Fig.5 The influence of number of extraction times on flavonoid extraction

2.5 滇黃精總黃酮提取工藝的正交優(yōu)化實驗結(jié)果

由表2可知，各因素對滇黃精總黃酮提取工藝的影響大小為:B＞A=C＞D，即影響滇黃精總黃酮提取工藝最大的是液料比，其次是乙醇濃度和提取時間;影響最小的是提取次數(shù)。滇黃精黃酮正交實驗得到的最佳提取工藝條件為:A2B3C1D2乙醇濃度為80%、液料比為25∶1、提取時間為60min、提取次數(shù)為3次。滇黃精黃酮最大提取率為0.40%(mg/mg)。

表2 滇黃精總黃酮提取工藝的正交優(yōu)化實驗結(jié)果Table2 Results of L9(34)orthogonal test on flavonoid extraction

2.6 滇黃精總黃酮提取工藝的正交優(yōu)化實驗方差分析

方差分析結(jié)果表明，乙醇濃度對黃精總黃酮提取率的影響顯著，而液料比、超聲波時間有一定的影響。

表3 方差分析表Table3 Variance analysis

2.6 滇黃精總黃酮最佳提取條件驗證實驗

從正交實驗K值來看，最佳條件應(yīng)取A2B3C2D3，所以對實驗組合A2B3C1D2與A2B3C2D3進行比較，見表4。結(jié)果分別為0.396%和0.405%;實驗結(jié)果與推測結(jié)果相符，但是考慮到兩實驗結(jié)果相差為0.009%，因增加大量的提取時間對提取總量的影響甚小，所以采取A2B3C1D2組合。由上述實驗可知，A2B3C1D2組合實驗滇黃精黃酮的平均提取率為0.396%，與正交實驗所得的最佳提取條件下的提取率0.40%的偏差為0.25%，所以該正交實驗所得的實驗方法在實際實驗中具有較好的穩(wěn)定性。

2.7 滇黃精總黃酮清除DPPH自由基作用的測定

由圖6可知，滇黃精黃酮具有比同濃度的蘆丁較強的清除DPPH自由基的能力，而且滇黃精黃酮的濃度在0.010～0.060mg/mL之間具有較強的線性關(guān)系，當?shù)狳S精黃酮濃度大于0.060mg/mL時，清除DPPH自由基的能力不再隨滇黃精黃酮濃度的增加而增強。所以0.060mg/mL是滇黃精黃酮清除DPPH自由基的最佳濃度;此時滇黃精黃酮對DPPH自由基的清除率達到91.29%，遠高于同濃度蘆丁。

表4 最佳提取條件驗證實驗結(jié)果(%)Table4 Results of verified test(%)

圖6 滇黃精總黃酮、蘆丁清除DPPH自由基作用Fig.6 Scavenging effect on DPPH·of flavonoid and rutin

2.8 滇黃精總黃酮還原力的測定

由圖7可知，滇黃精總黃酮具有比同濃度蘆丁較強的還原能力，且隨著濃度的增加還原力呈增強趨勢。一種物質(zhì)的還原能力可以反映該種物質(zhì)潛在抗氧化性能，而且具有還原能力的物質(zhì)一般都是電子的供體，能夠還原脂質(zhì)過氧化過程中的中間氧化產(chǎn)物，因此具有初級或次級抗氧化的作用。所以滇黃精黃酮可以作為電子和質(zhì)子供體，終止自由基鏈反應(yīng)，取到很好的抗氧化作用。

圖7 滇黃精總黃酮、蘆丁還原力的測定Fig.7 Determination antioxidant effect of the flavonoid and rutin

3 結(jié)論

通過對滇黃精中黃酮提取工藝的研究表明，滇黃精中黃酮的最佳提取工藝條件為:超聲波功率500W、提取溫度20℃、乙醇濃度為80%、液料比為25∶1、提取時間為60min、提取次數(shù)為3次。在此條件下滇黃精黃酮提取率達到0.40%。通過對滇黃精黃酮清除DPPH自由基的能力和還原能力的實驗表明:滇黃精黃酮具有比蘆丁較強的抗氧化活性。因此對滇黃精黃酮提取工藝及活性的初步研究，可為今后對滇黃精黃酮的成分、結(jié)構(gòu)及藥學的研究提供了一定的研究資料。深入開展對滇黃精黃酮類化合物的研究，將有利于這種傳統(tǒng)中藥材的充分利用和資源保護。

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