高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定茶葉中290種農(nóng)藥殘留組分

賈 瑋，黃峻榕，凌 云，馮 峰，鄭月明，儲(chǔ)曉剛

(1．陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021;2．中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

茶葉是不可缺少的健康飲品，也是我國(guó)的重要出口農(nóng)產(chǎn)品，歐洲、日本是我國(guó)茶葉的重要進(jìn)口國(guó)。茶葉進(jìn)出口國(guó)在制定茶葉標(biāo)準(zhǔn)時(shí)需綜合考慮茶葉食品安全和商品進(jìn)出口兩個(gè)方面。歐盟和日本作為農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)口國(guó)，制定的許多農(nóng)藥最大殘留標(biāo)準(zhǔn)都非常嚴(yán)格。國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)、歐盟、日本規(guī)定茶葉中最高農(nóng)藥殘留限量(MRL)分別為0.10～50.0、0.01～30.0、0.01～30.0 mg/kg，沒(méi)有明確規(guī)定殘留限量的均默認(rèn)為0.01 mg/kg［1］。

茶葉中農(nóng)藥殘留的常用檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)［2］、氣相色譜法(GC)［3－4］、氣相色譜 －質(zhì)譜法(GC －MS)［5－7］、液相色譜法(HPLC)［8］、液相色譜 － 質(zhì)譜法(LC － MS)［9－10］、液相色譜 －串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS)［11－14］等。ELISA、GC和HPLC的方法靈敏度較低，選擇性和特異性較差，不適于多種農(nóng)殘痕量分析的要求。GC－MS和LC－MS雖然方法靈敏度和特異性較高，但由于難以完全闡明化合物的結(jié)構(gòu)裂解信息，定性準(zhǔn)確度方面尚有欠缺，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。而液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS)因具有靈敏、準(zhǔn)確和快速等特點(diǎn)，適用于分析基質(zhì)復(fù)雜、背景干擾嚴(yán)重的痕量化合物，同時(shí)可在碰撞誘導(dǎo)解離模式下，得到其碎片離子的分子質(zhì)量，從而進(jìn)一步對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律加以確證，定性準(zhǔn)確性高。目前，尚未有應(yīng)用LC－MS/MS法單針進(jìn)樣同時(shí)分析茶葉中200多種農(nóng)藥的文獻(xiàn)報(bào)道。

茶葉與其他植物源性食品相比，富含茶多酚類(lèi)和色素類(lèi)化合物，經(jīng)不同工藝加工的茶葉產(chǎn)品成分也有很大差異。在農(nóng)藥殘留測(cè)定時(shí)，不同的成分造成的干擾也會(huì)有所不同。因而其農(nóng)殘檢測(cè)凈化方式多采用傳統(tǒng)方法，但這些前處理技術(shù)過(guò)程復(fù)雜，步驟繁瑣，試劑用量大，檢測(cè)成本高，干擾較大且不能滿足大批量樣品多組分快速測(cè)定要求。且針對(duì)四類(lèi)茶葉樣品，同時(shí)采用3個(gè)版本的QuEChERS前處理技術(shù)(2003 Oringinal，AOAC 2007.12008 CEN 15662)進(jìn)行比較并優(yōu)化尚未見(jiàn)報(bào)道［15－17］。

本研究采用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，針對(duì)四類(lèi)茶葉樣品，同時(shí)對(duì)3個(gè)版本的QuECh-ERS前處理技術(shù)進(jìn)行比較，并優(yōu)化了色譜質(zhì)譜條件，以改進(jìn)的QuEChERS方法為前處理手段，建立了茶葉中290種農(nóng)藥殘留的定性確證和定量測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Ultra高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);高速組織搗碎機(jī)(美的);Avnti J－26×PI型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司);Vortex.Genie2T旋渦混合器(美國(guó)Scientific Industries);振蕩器(日本Yamata SA31);超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器有限公司);微孔濾膜(0.20 μm，美國(guó)Pall公司);真空氮?dú)獯蹈蓛x(美國(guó)Caliper公司)。

甲醇、乙腈(HPLC級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);C18吸附劑、N-丙基乙二胺吸附劑(PSA，粒徑范圍40～60 μm，平均孔徑100 ，美國(guó)安捷倫科技有限公司);石墨化炭黑(GCB，粒徑范圍40～120 μm，美國(guó)Supelco公司);無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、無(wú)水醋酸鈉(優(yōu)級(jí)純，上海國(guó)藥集團(tuán))，500℃灼燒4 h，置于干燥器中備用;倍半水合檸檬酸二鈉、二水合檸檬酸鈉(優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Sigma公司);乙酸、甲酸、甲酸銨、甲苯(色譜純，美國(guó)Sigma公司)。實(shí)驗(yàn)用水均為高純水(經(jīng)Milli-Q超純水器純化)。

290種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確稱(chēng)適量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇制成1 000.0 mg/L單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－24℃冰箱中保存，根據(jù)需要用甲醇水混合溶液(1∶1)稀釋配制成相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液:移取10份各5 mL的空白樣品提取液于15 mL樣品瓶中，以真空氮?dú)獯蹈蓛x吹至近干，分別加入1 000 μg/L的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、4 000、5 000 μL于樣品瓶中，各補(bǔ)加甲醇至5 mL，再加5 mL 8 mmol/L甲酸銨水溶液，配制成1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、400、500 μg/L相應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 色譜質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Accucore aQ柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)、Accucore C18預(yù)柱(10 mm×2.1 mm，2.6 μm)均為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。柱溫:35℃;流動(dòng)相A為0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨水溶液，流動(dòng)相B為0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨甲醇溶液。梯度洗脫程序:0～1 min，100%A;1～35 min，100% ～0%A;35～40 min，0%A;40～40.1 min，0% ～100%A;40.1～45 min，100%A;流速為300 μL/min;碰撞氣:高純氬氣(純度≥99.999%)，碰撞氣壓力:0.2 Pa;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化，正負(fù)離子模式自動(dòng)切換，鞘氣壓力:275 kPa，輔助氣流速3 L/min，毛細(xì)管電壓:正離子模式3 000 V，負(fù)離子模式2 500 V，Tube lens補(bǔ)償電壓:152 V，Skimmer電壓:20 V。毛細(xì)管溫度350℃，霧化溫度(輔助氣):295℃，掃描速度:0.2 s，掃描方式:動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(EZ MRM)。質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3 樣品前處理方法

分別取試樣于食品搗碎機(jī)粉碎，過(guò)0.3 mm篩，混勻。稱(chēng)取粉碎混勻試樣各10 g(精確至0.01 g)于50 mL具塞離心管中，加入20 mL水浸泡30 min，加入20 mL 1%乙酸－乙腈混合溶液、2.0 g氯化鈉渦旋混合30 s后加入6.0 g無(wú)水硫酸鎂、1.5 g無(wú)水醋酸鈉，渦旋30 s，振蕩提取5 min，以10 000 r/min離心5 min，取上層溶液10 mL于預(yù)先加有75 mg GCB、400 mg PSA及1.2 g無(wú)水硫酸鎂的離心管中，高速渦旋30 s，加入0.7 mL甲苯，高速渦旋30 s，以10 000 r/min離心5 min，上層溶液經(jīng)0.20 μm有機(jī)系微孔膜過(guò)濾，取200 μL濾液至進(jìn)樣瓶中，加入300 μL乙腈及500 μL 8 mmol/L甲酸銨溶液。供高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 農(nóng)藥品種的篩選

根據(jù)世界各國(guó)和我國(guó)茶葉中農(nóng)藥的最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)［1］，本研究組對(duì)400種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):沒(méi)有找到母離子(如雙甲脒、DMSA)、子離子(如百草枯、四氟菊酯)和儀器響應(yīng)過(guò)低(如 唑脒、拿草特)的農(nóng)藥有90多種，加標(biāo)回收率小于70%或大于130%的農(nóng)藥(如 唑隆、除喹禾靈)有10種。最終確定對(duì)290種農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

用儀器自帶的針泵以流動(dòng)注射方式將樣品通過(guò)三通與流動(dòng)相混合后，分別在電噴霧離子源正離子電離(ESI+)模式和負(fù)離子電離(ESI－)模式下對(duì)290種農(nóng)藥的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，選擇母離子響應(yīng)較高的模式，再對(duì)其子離子全掃描，每個(gè)化合物選擇2對(duì)響應(yīng)值較高的特征離子對(duì)作為定量及定性離子對(duì)進(jìn)行MRM參數(shù)優(yōu)化，優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。其中雙特松與敵敵畏，二丙烯草胺與咯喹酮，氯苯胺、靈敵草、凈辛噻酮、西草凈及辛噻酮等相對(duì)分子質(zhì)量相同，保留時(shí)間一致，相互間易產(chǎn)生干擾，所以這些化合物需再加入1對(duì)定性離子對(duì)予以區(qū)別。

圖1 不同流動(dòng)相體系下6種農(nóng)藥的色譜峰響應(yīng)值Fig.1 Chromatographic response of 6 pesticides in different mobile phases

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇 色譜柱采用Thermo Scientific Accucore 2.6 μm填料，在加快分析速度、提高色譜柱分離度的同時(shí)，還能增加峰容量，改善復(fù)雜基質(zhì)中化合物的分離，同時(shí)消除了使用小顆粒填料所造成的高反壓?jiǎn)栴}。本文考察了Accucore系列中RP－MS、C18和aQ 3種不同選擇性的 HPLC色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)對(duì)上述290種農(nóng)藥的分離效果。結(jié)果表明采用Accucore aQ色譜柱可獲得最理想的分離效果。

2.3.2 流動(dòng)相的優(yōu)化 由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)，因此流動(dòng)相的組成和添加劑除了影響分析物的保留時(shí)間和峰形外，還會(huì)影響到分析物的離子化效率，從而影響到目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分別以甲醇－水、乙腈－水作為流動(dòng)相考察290種農(nóng)藥的分離度、峰形及響應(yīng)值，以對(duì)硫磷(Parathion)、殺螟松(Fenitrothion)、樂(lè)果(Dimethoate)、八甲磷(Schradan)、二氧威(Dioxacarb)和苯噻草胺(Mefenacet)為例，發(fā)現(xiàn)以甲醇－水為流動(dòng)相的離子化效率明顯好于乙腈－水流動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入甲酸和甲酸銨可提高目標(biāo)化合物的響應(yīng)值(見(jiàn)圖1)，而加入乙酸銨響應(yīng)值降低，因此確定以0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨水溶液和0.1%甲酸－4 mmol/L甲酸銨甲醇溶液為流動(dòng)相。圖2為按“1.3”方法進(jìn)行前處理后烏龍茶混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖。

圖2 290種農(nóng)藥的烏龍茶標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/L)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatograms of 290 pesticides standard at 20 μg/L prepared in oolong tea

2.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.4.1 提取條件的優(yōu)化 茶葉為干性樣品，加入乙腈提取前用水浸泡30 min，可以增加溶劑的提取效率。加入氯化鈉使得水與乙腈分層，渦旋后再加入無(wú)水硫酸鎂，其中氯化鈉需先于無(wú)水硫酸鎂加入溶液，避免同時(shí)加入后無(wú)水硫酸鈉遇水直接結(jié)塊，從而將目標(biāo)化合物包裹，影響農(nóng)藥的提取率。無(wú)水硫酸鎂用于吸取鹽析分配后有機(jī)層中多余的水分。為研究無(wú)水硫酸鎂及無(wú)水硫酸鈉的使用對(duì)于農(nóng)藥提取效果的影響，按照“1.3”的前處理方式分別加入6.0 g無(wú)水硫酸鎂與6.0 g無(wú)水硫酸鈉，農(nóng)藥添加水平為10 μg/L，以苯噻草胺(Mefenacet)、滅線磷(Ethoprophos)、咪唑菌酮(Fenamidone)、芐草隆(Cumyluron)、殺草凈(Dipropetryn)和嘧菌酯(Azoxystrobin)6種農(nóng)藥的回收率為考察對(duì)象。其中苯噻草胺是除草劑中的噻唑多環(huán)化合物，滅線磷是有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑，咪唑菌酮為含苯胺基的殺菌劑，芐草隆為含苯甲基除草劑，殺草凈為三嗪類(lèi)芽前除草劑，嘧菌酯為甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑，這些化合物能代表大多數(shù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用無(wú)水硫酸鎂的回收率優(yōu)于無(wú)水硫酸鈉(見(jiàn)圖3)，原因?yàn)樵趦艋襟E中采用的PSA屬于正相吸附劑，含水量越少凈化效果越好，無(wú)水硫酸鎂的吸水能力更佳，且其粒度更小，在振搖與渦旋的過(guò)程中可使樣品更加粉碎，并通過(guò)與乙腈發(fā)生協(xié)同作用，提高提取效率［18］。

圖3 2種QuEChERS樣品前處理方法對(duì)10 μg/L加標(biāo)烏龍茶樣品的回收率比較(n=7)Fig.3 Comparison of recoveries of two versions of QuEChERS sample preparation method for oolong tea samples spiked with 10 μg/L pesticides(n=7)

圖4 3種QuEChERS樣品前處理方法對(duì)10 μg/L加標(biāo)烏龍茶樣品的回收率比較(n=7)Fig.4 Comparison of recoveries of three versions of QuEChERS sample preparation method for oolong tea samples spiked with 10 μg/L pesticides(n=7)

由于涉及的農(nóng)藥種類(lèi)較多，為了保證酸堿不穩(wěn)定的農(nóng)藥不分解，需要加入緩沖鹽體系來(lái)保持基質(zhì)環(huán)境的pH值。因此，考察了緩沖鹽的使用對(duì)于農(nóng)藥提取效果的影響，根據(jù)2003 Oringinal、國(guó)際官方方法AOAC 2007.01與歐洲標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)方法CEN 151662進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，第一組加入1.5 g乙酸鈉和在乙腈中加入1%乙酸(AOAC 2007.01)，第二組加入0.5 g倍半水合檸檬酸二鈉和1.0 g二水合檸檬酸鈉(CEN 151662)，第三組不加緩沖鹽(Oringinal)。農(nóng)藥添加水平為10 μg/L，以對(duì)硫磷(Parathion)、殺螟松 (Fenitrothion)、樂(lè)果(Dimethoate)、八甲磷(Schradan)、二氧威(Dioxacarb)和多菌靈(Carbendazim)6種農(nóng)藥的回收率為考察對(duì)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入乙酸和乙酸鈉后，除多菌靈的回收率變化不大，對(duì)硫磷、殺螟松、樂(lè)果、八甲磷和二氧威的回收率均有所提高(見(jiàn)圖4)。其原因?yàn)椴捎靡宜岷鸵宜徕c體系可保證樣品基質(zhì)環(huán)境的pH值為5.0～5.5，這既可以保證堿不穩(wěn)定的農(nóng)藥(如對(duì)硫磷、殺螟松、樂(lè)果)的回收率，也可以保證酸不穩(wěn)定的農(nóng)藥(如樂(lè)果、八甲磷)的回收率，而多菌靈在酸堿溶液中均具有良好的穩(wěn)定性，所以其回收率變化不大。第一組與第二組均可保證樣品基質(zhì)的pH值在整個(gè)過(guò)程中分別保持在5.0～5.5與4.8，且以上6種農(nóng)藥的回收率十分接近，但從實(shí)驗(yàn)緩沖能力與成本考慮，最終選擇乙酸與乙酸鈉緩沖鹽體系。

2.4.2 凈化條件的優(yōu)化 Oringinal、國(guó)際官方方法AOAC 2007.01與歐盟標(biāo)準(zhǔn)方法CEN 151662的另一處不同在于前兩者均未提及添加C18與石墨化炭黑(GCB)，而后者可以。C18屬于反相吸附劑，可有效除去基質(zhì)中的脂肪和脂類(lèi)等非極性有機(jī)物，為研究C18的使用對(duì)于農(nóng)藥提取效果的影響，分別進(jìn)行添加500 mg C18和不添加C18對(duì)比實(shí)驗(yàn)，農(nóng)藥添加水平為10 μg/L，以苯噻草胺(Mefenacet)、滅線磷(Ethoprophos)、咪唑菌酮(Fenamidone)、芐草隆(Cumyluron)、殺草凈(Dipropetryn)和嘧菌酯(Azoxystrobin)6種農(nóng)藥的回收率為考察對(duì)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組農(nóng)藥的回收率相近(見(jiàn)圖5)，其原因?yàn)椴枞~中的脂類(lèi)等非極性有機(jī)物含量較低，而且在提取溶劑中溶解較少。所以針對(duì)茶葉樣品，本實(shí)驗(yàn)不加入C18。

圖5 2種QuEChERS樣品前處理方法對(duì)10 μg/L加標(biāo)烏龍茶樣品的回收率比較(n=7)Fig.5 Comparison of recoveries of two versions of QuEChERS sample preparation method for oolong tea samples spiked with 10 μg/L pesticides(n=7)

歐盟標(biāo)準(zhǔn)方法CEN 151662規(guī)定，在深色樣品中可加入少量石墨化炭黑(GCB)除色，茶葉樣品經(jīng)溶劑提取后(不加入GCB)，由于其提取液中存在葉綠素、胡蘿卜素、葉黃素與花青素，且PSA只能除去少量色素，提取液呈墨綠色(綠茶)、棕紅色(烏龍茶、紅茶)、棕黑色(普洱茶)。為了確定GCB用量，分別在10 mL各種茶葉提取液中添加40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 mg GCB，高速渦旋30 s，以10 000 r/min離心5 min，觀察提取液顏色。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入75 mg GCB時(shí)，提取液為黃色透明(烏龍茶、紅茶、普洱茶)或無(wú)色透明(綠茶)。但GCB外層為6個(gè)碳原子構(gòu)成的平面六角形，對(duì)于片狀化合物有強(qiáng)烈的吸附作用，隨著GCB的加入會(huì)導(dǎo)致片狀農(nóng)藥(如滅線磷 (Ethoprophos)、氧環(huán)唑(Azaconazole)、腈苯唑(Fenbuconazole)、吡螨胺(Tebufenpyrad)、克百威(Carbofuran)、嘧霉胺(Pyrimethanil)的回收率降低，通過(guò)在提取液中加入甲苯可以洗脫被GCB吸附的農(nóng)藥，提高該類(lèi)農(nóng)藥的回收率。為了確定甲苯的加入量，實(shí)驗(yàn)中加入75 mg GCB，農(nóng)藥添加水平為10 μg/L，以上述6種農(nóng)藥的回收率為考察對(duì)象，結(jié)果見(jiàn)圖6，發(fā)現(xiàn)加入0.7 mL甲苯可將被GCB吸附的農(nóng)藥洗脫;但會(huì)對(duì)原來(lái)未加入甲苯時(shí)回收率好的農(nóng)藥，例如敵敵畏(Dichlorvos)、非草隆(Fenuron)造成影響，原因?yàn)槿芤褐谢|(zhì)雜質(zhì)增加。綜合上述結(jié)果，實(shí)驗(yàn)條件確定為取上層溶液10 mL于預(yù)先加有75 mg GCB、400 mg PSA及1.2 g無(wú)水硫酸鎂的離心管中，高速渦旋30 s，再加入0.7 mL甲苯。

圖6 甲苯加入量對(duì)部分農(nóng)藥回收率的影響Fig.6 Influence of toluene volume used in purification on recoveries of 8 pesticides

根據(jù)2003 Oringinal、國(guó)際官方方法AOAC 2007.01與歐盟標(biāo)準(zhǔn)方法CEN 151662中各種提取劑與凈化劑的用量，本實(shí)驗(yàn)在整個(gè)過(guò)程中對(duì)PSA、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉與緩沖鹽的用量進(jìn)行了優(yōu)化，過(guò)程與上述方法相似，形成了適合于茶葉樣品的QuEChERS前處理方式(見(jiàn)“1.3”)。

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng) 目標(biāo)化合物的電離容易受到基質(zhì)的干擾，導(dǎo)致離子抑制或增強(qiáng)，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值比純?nèi)軇┑母?見(jiàn)圖2)，且這種影響在各待測(cè)物之間存在差異，表明不同農(nóng)藥受到基質(zhì)的影響不同。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)影響過(guò)大時(shí)，會(huì)降低方法的靈敏度，影響方法的準(zhǔn)確性，因此需要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)方法為:基質(zhì)效應(yīng)=(1－基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%［19］。結(jié)果表明在290種農(nóng)藥中普遍存在基質(zhì)效應(yīng)，其中19.2%屬于中等強(qiáng)度的基質(zhì)效應(yīng)，2.5%屬于強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，79.3%為較弱基質(zhì)效應(yīng)。為最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)干擾，本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配法進(jìn)行定量分析。以空白茶葉樣品的提取液為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有相同的離子化環(huán)境，從而消除基質(zhì)效應(yīng)。

由于測(cè)定的化合物較多，本實(shí)驗(yàn)對(duì)化合物保留時(shí)間的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，分別對(duì)質(zhì)量濃度為20 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)定7次，同樣方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的化合物出峰時(shí)間穩(wěn)定，漂移時(shí)間均小于1.2 s;基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液較純標(biāo)準(zhǔn)溶液出峰晚1～9 s，這與María等［20］的測(cè)定結(jié)果相同，其原因?yàn)榛|(zhì)進(jìn)入色譜后影響了色譜柱的柱效。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 配制290種農(nóng)藥質(zhì)量濃度依次為1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)組分的峰面積(y)對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，各種農(nóng)藥質(zhì)量濃度在1.0～200 μg/L范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。用本方法對(duì)綠茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以信噪比(S/N)≥10確定290種農(nóng)藥的定量下限均可達(dá)到0.01 mg/kg。

2.5.2 精密度與加標(biāo)回收率 對(duì)比CAC、歐盟、日本、中國(guó)茶葉農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，歐盟的最高殘留限量(MRL)的規(guī)定最為嚴(yán)格，本文根據(jù)歐盟最高殘留限量(沒(méi)有MRL規(guī)定的按照日本《食品中農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度》中的“一律標(biāo)準(zhǔn)”與歐盟規(guī)定的0.01 mg/kg標(biāo)準(zhǔn))的1倍、2倍、4倍進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明目標(biāo)分析物的回收率均在61%～119%范圍內(nèi)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)7次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.4%，加標(biāo)濃度為MRL(沒(méi)有限量規(guī)定的按照0.01 mg/kg進(jìn)行加標(biāo))的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 290種農(nóng)藥的保留時(shí)間、質(zhì)譜分析參數(shù)、相關(guān)系數(shù)(r2)、平均回收率與精密度(n=7)Table 1 Retention times，mass spectrometric parameters，correlation coefficients(r2)，recoveries and precisions of 290 pesticides(n=7)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

2.6 實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)市售綠茶、烏龍茶、紅茶、普洱茶樣品共10份進(jìn)行了290種農(nóng)殘檢測(cè)，其中1份檢出啶蟲(chóng)脒(Acetamiprid)和甲胺磷(Methamidophos)，含量分別為28 μg/kg和37 μg/kg;1份檢出吡蟲(chóng)啉(Imidacloprid)和噻蟲(chóng)嗪(Thiamethoxam)，含量分別為12 μg/kg和19 μg/kg;1份檢出乙酰甲胺磷(Acephate)、樂(lè)果(Dimethoate)、氧化樂(lè)果(Omethoate)、三唑磷(Triazophos)、亞胺硫磷(Phosmet)、三唑酮(Triadimefon)、噻嗪酮(Buprofezin)、水胺硫磷(Isocarbophos)、喹硫磷(Quinalphos)、噠螨靈(Pyridaben)和吡蟲(chóng)啉(Imidacloprid)，含量分別為 18、26、39、43、29、68、82、29、46、25、14 μg/kg。研究結(jié)果表明，本方法可用于茶葉中290種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC－MS/MS)進(jìn)行測(cè)定，采用QuEChERS方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，建立了茶葉中290種農(nóng)藥殘留量的測(cè)定方法，方法具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，線性關(guān)系良好，能滿足我國(guó)、日本和歐盟等國(guó)家與組織對(duì)于多農(nóng)殘分析的要求。

致謝:感謝美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司James Chang和Jia Wang工程師在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的幫助和支持。

［1］ General Administration of Quality Supervision，Inspection and Quarantine of the People s Republic of China．Pesticide Residue Limits(國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局．農(nóng)藥殘留限量查詢(xún))．［2012－06－17］．http://www.tbtsps.com/FOODSAFE/XLBZ/Pages/pesticide.aspx．

［2］ Nuria S，Bego a V，Berta B，Marco M．Talanta，2012，89(30):310 －316．

［3］ Flaviane A S，Anna I G C，Maria E L R Q，Reinaldo F T，Ant nio A N，Gevany P P．Food Chem．，2012，135(1):179－185．

［4］ Liu D，Min S G．J.Chromatogr.A，2012，1235(27):166－173．

［5］ Chen L，ShangGuan L M，Wu Y Y，Xu L J，F(xiàn)u F F．Food Control，2012，25(2):433 －440．

［6］ Li B，Zeng F G，Dong Q C，Cao Y，F(xiàn)an H T，Deng C F．Phys．Procedia，2012，25(3):1776 －1780．

［7］ Milagros M，Angeles M，Amadeo R．J.Chromatogr.，2012，1100(3):605－619．

［8］ Virginia P，Elena D，Bezhan C，Antonio L，Maria G，Maria L M．J.Chromatogr.A，2012，1234(20):22－31．

［9］ Claudia O，Wolfgang S．J.Chromatogr.A，2011，1218(37):6540－6547．

［10］ Emilia F，Anna S．J.Chromatogr.B，2012，901(15):107－114．

［11］ Oscar N，Héctor G，Imma F，Encarnación M，Maria T G．J.Chromatogr.A，2012，1249(3):164 －180．

［12］ László P，Juan F G R，Péter F，Attila G，Mihály D，László A，Bienvenida G，Antonio M．J.Chromatogr.A，2012，1249(3):83－91．

［13］ Zhu W X，Yang J Z，Liu Y F，Wei W．J.Instrum.Anal．(祝偉霞，楊冀州，劉亞風(fēng)，魏蔚．分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2010，29(11):1109－1113．

［14］ Xu J，Chen J，Ye H Y，Wang L，Sun L H，Lai Z F．J.Instrum.Anal．(徐娟，陳捷，葉弘毅，王嵐，孫靈慧，賴(lài)子峰．分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2011，30(9):990－995．

［15］ Anastassiades M，Lehotay S J，Stajnbaher D，Schenck F J．J.AOAC Int．，2003，86(2):412 －431．

［16］ Lehotay S J，Katerˇina M，Alan R L．J.AOAC Int.，2005，88(2):615 －629．

［17］ Anastassiades M．prEN 15662．Determination of Pesticide Residues Using GC－MS and/or LC－MS(/MS)Following Acetonitrile Extraction/Ppartitioning and Ccleanup by Dispersive SPE－QuEChERS Method．European Commitee for Standardization．

［18］ Lehotay S J．J.AOAC Int．，2007，90(2):485 －520．

［19］ Anastasios E，Helen B，Spyros A，Despina T．J.Chromatogr.A，2009，1216(31):5856 －5867．

［20］ María L G P，Patricia P B，Roberto R G，José L M V，Antonia G F．J.Chromatogr.A，2012，1248(27):130－138．