固相萃取/超高效液相色譜法測定龍膽瀉肝丸中梔子苷、龍膽苦苷與黃芩苷

張 勇，薛昆鵬，何 美，陳再潔，吳 虹，趙岳星

(1.安徽中醫(yī)學院 藥學院，安徽 合肥 230031;2.月旭材料科技(上海)有限公司，上海 201203)

龍膽瀉肝丸是名方龍膽瀉肝湯的一種制劑，由龍膽、梔子、黃芩、澤瀉等10味藥物組成，具有瀉肝膽、利濕熱等功效，主治肝膽實火上擾。藥方中龍膽為君，梔子、黃芩為臣［1］，有效成分分別為龍膽苦苷、梔子苷和黃芩苷(化學結(jié)構(gòu)式如圖1)，其中龍膽苦苷和梔子苷均屬于環(huán)烯醚萜苷類成分，其化學結(jié)構(gòu)非常相近，用高效液相色譜(HPLC)進行檢測時易相互干擾［2］。

目前2010版《中國藥典》1部中的龍膽瀉肝丸已收載了3個成分的含量測定方法［3］，然而，由于本品成分復雜，測定時不僅易產(chǎn)生干擾和誤差，其所含的非指標性成分在采用HPLC測定時保留時間較長(全程60 min)，影響其3個成分的快速、準確測定。因而，本研究利用固相萃取(SPE)技術(shù)對本品進行預處理后采用超高效液相色譜(UPLC)法進行測定［4］，使分析時間降低至13 min，且所得峰形對稱，便于保護UPLC細粒徑色譜柱。該方法簡便易行，可更好、更快地用于該制劑的質(zhì)量控制。

圖1 梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷的化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of geniposide，gentiopicroside and baicalin

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity H－Class UPLC超高效液相色譜儀、Empower 2色譜數(shù)據(jù)工作站(美國Waters公司)，Milli-Q超純水制備系統(tǒng)(美國Millipore公司)，CP225D型電子天平(德國Sartorius公司)，KQ-200KDB超聲波提取器(220 V，50 kHz)，WelchromC18E固相萃取柱(200 mg/3 mL，月旭科技公司)。

龍膽瀉肝丸(水丸，規(guī)格:6 g/100粒;批號:0083081、0083082、0083083，北京同仁堂制藥有限公司);龍膽苦苷對照品(110770－201013)、梔子苷對照品(110749－200714)、黃芩苷對照品(110715－201016)購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈(色譜純，美國天地公司)。

1.2 標準溶液的配制

精密稱取梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷對照品各0.80、1.07、2.05 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品混合溶液。

1.3 樣品前處理

取適量龍膽瀉肝丸，研細，分取兩份，按照如下步驟制備樣品溶液。

1.3.1 樣品的提取 精密稱定研好的粉末1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇水溶液，蓋緊瓶塞，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，用50%甲醇補足重量，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，得樣品提取液，待凈化。

1.3.2 樣品的凈化 依次用甲醇、超純水和50%甲醇各5 mL活化C18固相萃取柱［5］，隨后精密移取5 mL上述處理好的樣品提取液加載到活化后的C18柱上，控制流速為1滴/s，棄去初濾液2.5 mL，收集后續(xù)的流出液，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾，以備測定。

1.4 儀器條件

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離體系的優(yōu)化

采用UPLC對目標物質(zhì)進行快速分析，選擇1.8 μm粒徑的C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)當選擇2.1 mm×50 mm和2.1 mm×100 mm兩種型號色譜柱時，梔子苷和龍膽苦苷很難分離，而選擇4.6 mm×50 mm色譜柱，樣品可達到基線分離，原因可能是由于中藥樣品基質(zhì)復雜，選擇太細的色譜柱，填料量過少使得樣品過載而無法分離;流動相參照2010版中國藥典1部及其他文獻進行對比分析［2－3，6－8］，發(fā)現(xiàn)在甲醇－0.2%磷酸體系下，峰形拖尾嚴重;在乙腈－1%醋酸體系下，梔子苷和龍膽苦苷無法達到基線分離;而選用乙腈－0.1%磷酸體系時，所得峰形較好，分離度滿足要求，且分析總時間相比于藥典方法縮短了一半(見圖2)，并且藥典方法選用的流動相(0.2%磷酸溶液)pH值過低(pH＜2.0)，不適于色譜柱的長期使用。

2.2 流動相條件的優(yōu)化

以不同比例的乙腈－0.1%磷酸水溶液進行初始梯度設(shè)置，發(fā)現(xiàn)當乙腈初始含量低于12%時，龍膽苦苷和梔子苷的保留時間均會延后，且分離度隨之下降，當乙腈達5%時兩峰完全重疊。而乙腈初始含量高于12%時，兩峰的分離度雖然有所提高，但出峰太快，導致與前面峰難以分離，因此，選擇12%乙腈－0.1%磷酸水溶液作為最佳初始流動相。

圖2 3種化合物在不同分離體系下的色譜圖Fig.2 Comparison of chromatograms of three compounds under different systems

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

考察了直接提取和使用SPE凈化兩種前處理方式時目標物的分離效果。結(jié)果表明:直接提取的樣品，需在11.5 min后漸進提高乙腈比例至50%，才能將黃芩苷出峰后的非指標性成分洗脫，而采用SPE凈化后的樣品，由于去除了大量雜質(zhì)的干擾，不需要用高比例有機相進行后續(xù)雜質(zhì)的洗脫，大大縮短了平行進樣梯度系統(tǒng)平衡的時間。

2.4 SPE凈化條件的優(yōu)化

本實驗將50%甲醇提取液直接經(jīng)C18固相萃取柱進行凈化，在此洗脫溶劑系統(tǒng)下，每隔0.5 mL收集流出液，共收集9管。以流出體積為橫坐標，3個成分的吸收峰面積為縱坐標作流出曲線，結(jié)果在第6管即初濾液在2.5 mL后，流出液的梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷的峰面積已達平衡，因此最終選擇流出液的初濾液體積為2.5 mL。這主要是利用待測成分在樣品液與C18固定相之間達成分配平衡后，流出液與樣品液中所含待測成分的濃度一致，而此時樣品溶液中對C18分配系數(shù)較大的成分仍保留在萃取柱中，從而達到排除干擾物質(zhì)、減少分離時間和保護色譜柱的目的［9］。為考察待測組分的飽和流出曲線受洗脫溶劑極性的影響，將樣品提取液的甲醇含量分別調(diào)至40%和60%進行平行洗脫，發(fā)現(xiàn)在40%甲醇洗脫溶劑下，10 mL內(nèi)無法達到3種待測組分的流出平衡，而在60%甲醇洗脫溶劑下，柱上強保留的雜質(zhì)均洗脫下來，對黃芩苷的分離產(chǎn)生干擾。綜合考慮，選擇50%甲醇作為SPE的洗脫溶劑。

2.5 流速與柱溫的優(yōu)化

考察了不同柱溫和流速對各組分分離度的影響，結(jié)果見表1。由表1可知:流速為0.7 mL/min時，梔子苷與龍膽苦苷的分離度較好，但黃芩苷與前后峰的分離度不理想;在相同條件下流速增加到0.8 mL/min時，3種主要成分的分離度均較佳，且保留時間縮短;當流速增加到0.9 mL/min時，三者的分離度未改善，反而有所降低。柱溫為20℃時，梔子苷與龍膽苦苷能得到良好分離，黃芩苷與前一個雜質(zhì)峰分離較好，與其后的雜質(zhì)峰分離度基本滿足定量要求;柱溫升至25℃時，各主要成分的分離度均大于1.5，符合要求;當柱溫為30℃時，各組分的分離度均降低。綜合考慮，流速選擇0.8 mL/min，柱溫選擇25℃。

表1 3種成分在不同流速和不同柱溫下的分離度Table 1 Resolutions of three compounds under different flow rates and column temperatures

2.6 方法的精密度、線性范圍、檢出限與定量下限

取“1.2”對照品混合標準溶液，按本方法進行分析，于同日內(nèi)測定6次，連續(xù)測定5日，測得梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷峰面積的日內(nèi)和日間精密度;將對照品混合溶液分別進樣0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0 μL進行測定，以峰面積(Y)對標樣的進樣量(X，ng)進行線性回歸，得到各化合物的線性回歸方程;并以3倍信噪比(S/N=3)所對應的濃度為檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)對應的濃度為定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2。從表2可看出，梔子苷在12.8～128 ng，龍膽苦苷在17.2～172 ng和黃芩苷在32.8～328 ng范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，日內(nèi)和日間相對標準偏差均不超過1.8%。

表2 方法的精密度、線性范圍、檢出限及定量下限(n=6)Table 2 Precision，calibration curve，LOD and LOQ of the method(n=6)

2.7 方法的重復性、穩(wěn)定性及專屬性

精密稱取同一批號龍膽瀉肝丸1 g，按“1.3.2”方法制備6份供試品溶液進行測定，得到梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷的RSD分別為1.7%、0.8%和0.7%。

重新制取一份供試品溶液，分別在0、1、2、4、8、12 h進行測定，3個成分的 RSD分別為0.7%、1.2%和0.9%，表明12 h內(nèi)3個成分在供試品溶液中基本穩(wěn)定。

按處方比例分別制取缺梔子、缺龍膽和缺黃芩的陰性樣品，精密稱取1 g，按照“1.3.2”方法，制備陰性樣品溶液后進行測定，色譜對比圖見圖3。結(jié)果顯示對梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷的含量測定無干擾，專屬性良好。

圖3 混合對照品(A)、供試品(B)、缺梔子陰性樣品(C)、缺龍膽陰性樣品(D)、缺黃芩陰性樣品(E)的UPLC色譜圖Fig.3 UPLC chromatograms of reference substances(A)，sample(B)，negative sample without Gardeniae Fructus(C)，negative sample without Gentianae Radix et Rhizoma(D)，negative sample without Scutellariae Radix(E)1.geniposide，2.gentiopicroside，3.baicalin

2.8 回收率實驗

精密稱取龍膽瀉肝丸(批號:0083081)粉末0.5 g 6份，分別精密加入對照品混合溶液(另配，梔子苷0.82 g/L，龍膽苦苷0.64 g/L，黃芩苷2.31 g/L)1 mL，按“1.3.2”方法制備溶液后測定，計算得梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷的平均回收率為99%、99%和95%，RSD分別為2.3%、1.9%和2.8%。黃芩苷回收率偏低可能是由于C18萃取柱填料對于分配系數(shù)大的組分部分吸附所致。

2.9 實際樣品的測定

分別取不同批號的龍膽瀉肝丸，按“1.3.2”方法處理，每批樣品制備3份，用標準曲線法分別計算3批樣品各成分的含量，測定結(jié)果見表3，該結(jié)果符合中國藥典含量測定規(guī)定。為進一步進行方法學驗證，采用現(xiàn)行國家藥品標準的常規(guī)HPLC方法，選擇島津LC－10A液相色譜儀，Ultimate AQ－C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，甲醇－0.2%磷酸梯度洗脫對3批龍膽瀉肝丸樣品進行檢測，每個樣品平行測定3次，測定結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)顯示，藥典法測定結(jié)果與本法測定結(jié)果具有良好的一致性。對兩種方法的檢測結(jié)果進行F值和t值檢驗，結(jié)果顯示，兩種方法之間無顯著性差異。此外，藥典法所需分析時間為60 min，流動相的pH值小于2.0，對梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷的定量下限分別為6.84、8.79、4.24 mg·L－1，相比于該方法，本實驗所建立的方法分析時間更短，靈敏度更高。

表3 兩種方法測定龍膽瀉肝丸含量數(shù)據(jù)對比Table 3 Determination results of different experimental methods in Longdanxiegan Pill w/(mg·g－1)

3 結(jié)論

本實驗建立的SPE/UPLC方法，可在較短時間內(nèi)實現(xiàn)對龍膽瀉肝丸中梔子苷、龍膽苦苷和黃芩苷三個指標成分的快速檢測。該方法靈敏度高、重復性好，可為今后該制劑的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

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