響應(yīng)曲面法優(yōu)化紅菜苔多酚提取工藝的研究

楊紅，操德群，朱江，謝順嵐，李建華

（特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北孝感 432000）

紅菜苔（Brassica.campestris L.var.purpurea Baileysh）紅菜苔又名蕓菜苔、紫菜苔等，是十字花科蕓苔屬蕓苔種白菜亞種的一個變種，廣泛種植于我國南方地區(qū)，因湖北武漢市洪山區(qū)所產(chǎn)的紅菜苔久負(fù)盛名，因此產(chǎn)自該地的紅菜苔又名“洪山菜苔”；紅菜苔外皮及葉脈均呈紫紅色，莖肉淺綠色；該蔬菜不僅適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高，其且營養(yǎng)全面，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、和人體必需的微量元素等[1]，在唐代曾被封為“金殿玉菜”。

植物多酚（plant polyphenol）又名植物單寧（vegetable tannin），是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝物質(zhì)，包括原花青素類、黃酮醇類、酚酸類、兒茶素類、花青素類和二羥查耳酮類等，主要存在于植物的皮、木、葉、根、果實(shí)等部位[2-4]。根據(jù)來源的不同，植物多酚亦被稱為如茶多酚[5]、葡多酚[6]、蘋果多酚[2]等。植物多酚具有抗氧化、抑制酶活性、抑菌、抗致突變、消炎、降血壓等多種生物活性[7]。

由于紅菜苔的葉子和莖皮的適口性不佳，許多人在食用時會剝?nèi)デo皮，并將其葉子幾乎全丟掉，只留頂尖的花和嫩葉，這樣就會產(chǎn)生很多的莖皮和葉子。由于紅菜苔的莖皮和葉片中富含植物多酚，采用適當(dāng)?shù)墓に?，提取紅菜苔莖皮和葉片中的多酚，對于充分開發(fā)利用紅菜苔，具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 原料試劑與儀器

1.1.1 原料

新鮮紅菜苔，產(chǎn)自湖北省孝感市。

1.1.2 試劑

沒食子酸、Folin-Ciocalteau 試劑、蒸餾水、乙醇、碳酸鈉溶液。

1.1.3 儀器

752 N 紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；康麗SO200-A 多功能攪拌機(jī)：順德市寶鋒電器廠；檢測檢驗(yàn)篩：浙江上虞市龍翔精密儀器廠；SHZ-ⅡD 型循環(huán)水真空泵：上海來榮生化儀器廠；202-2 型干燥箱：上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；PL203 型電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用Design-Expert 軟件中的中心組合設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）模塊中的二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了一組四因素五水平的共計(jì)31 次的實(shí)驗(yàn)（full CCD 設(shè)計(jì)），其中析因部分實(shí)驗(yàn)次數(shù)為16 次，星點(diǎn)數(shù)為6，保證均一精密性的中心點(diǎn)重復(fù)次數(shù)手動調(diào)整為7，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平見表1。

表1 中心組合設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Central Composite Design factors levels table

1.2.2 紅菜苔總多酚的提取

將紅菜苔葉及皮曬干至手捏即碎，粉碎過80 目篩，準(zhǔn)確稱取1.00 g 干粉末，按照中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)中設(shè)置的不同提取條件分別進(jìn)行浸提，離心收集各個提取條件下得到的提取液，備用。每個處理重復(fù)3 次。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與紅菜苔總多酚的測定

參照鄧義書等的方法，測定并繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[8]，得吸光度值y 與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x，mg/mL）之間的回歸方程為y=0.055 2x-0.030 5，決定系數(shù)R2值為0.992 4。這表明，沒食子酸質(zhì)量濃度與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。

取40 μL 紅菜苔葉和皮的多酚提取液于10 mL 試管中，加水3.16 mL，加200 μL Folin-Ciocalteau 試劑，混勻，在30 s 至8 min 內(nèi)加入600 μL 2 % 碳酸鈉溶液，混勻，于20 ℃保溫2 h，在765 nm 波長下比色，每樣重復(fù)測量3 次，取平均值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 軟件進(jìn)行多元回歸及方差分析。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

2.2 模型的建立及方差分析

利用Design—Expert 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸及方差分析（分析結(jié)果見表3），發(fā)現(xiàn)本研究符合二次方模型，經(jīng)過響應(yīng)曲面法的擬合計(jì)算得出該模型的決定系數(shù)R-Squared 為0.968 2，表明該模型具有較高的可信度；校正系數(shù)RAdj=0.940 3 表明在多酚含量總的變異中，有94.03%是由獨(dú)立變量引起的。R-Squared 失擬項(xiàng)用來檢測回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)值的擬合程度的好壞。如果失擬項(xiàng)顯著，說明影響響應(yīng)值的還有除溫度、保溫時間、乙醇濃度以及液固比以外的其它因素。失擬項(xiàng)的F=0.87，對應(yīng)的P=0.595 9＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，從而表明該模型能夠?qū)t菜苔多酚的提取進(jìn)行預(yù)測和分析。圖1 分析了模型的適應(yīng)性，由圖1 也可知，試驗(yàn)值大致對稱分布于預(yù)測值兩側(cè)，與預(yù)測值也比較接近，這說明該模型適應(yīng)性較高。

圖1 試驗(yàn)值與預(yù)測值對比圖Fig.1 Contrast diagram between actual values and prediction

紅菜苔多酚提取的方差分析結(jié)果見表3。

表3 二次多項(xiàng)式模型方差分析表Table 3 Variance analysis of quadratic multinomial model

通過方差分析可對模型的精確性做進(jìn)一步的判斷，該模型的F 值為34.76，因誤差而接受該模型的概率不到0.000 1，這表明模型的可信度很高，具有重要的參考價值；如果以0.05 作為顯著性標(biāo)準(zhǔn)的話，在該模型中，A、C、D、AD、BC、CD、C2、D2是顯著的模型項(xiàng)，表明溫度、乙醇濃度和液固比是影響紅菜苔多酚提取的關(guān)鍵性因素。

去掉不顯著的交互作用項(xiàng)，手動優(yōu)化可得簡化的回歸方程為：

優(yōu)化后模型的F 值52.32，對應(yīng)的P ＜0.000 1，因誤差而接受該模型的概率不到0.000 1，失擬項(xiàng)的F=0.92，對應(yīng)的P=0.588 1＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著；決定系數(shù)R-Squared 為0.957 3，校正系數(shù)RAdj為0.939 0，優(yōu)化后的決定系數(shù)與校正系數(shù)之差小于優(yōu)化前兩者之差，表明優(yōu)化后的回歸方程具有更高的可信度。

2.3 響應(yīng)曲面分析

利用Design Expert 7.0.0 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及其響應(yīng)面見圖2、圖3 和圖4。

圖2 提取溫度和液固比的等高線和響應(yīng)曲面圖Fig.2 Contour figure and response surface graph between extraction temperature and liquid-solid ratio

圖3 提取時間和乙醇濃度的等高線和響應(yīng)曲面圖Fig.3 Contour figure and response surface graph between extraction time and ethanol concentration

圖4 乙醇濃度和液固比的等高線和響應(yīng)曲面圖Fig.4 Contour figure and response surface graph between ethanol concentration and liquid-solid ratio

通過二次模型所得到的等高線及響應(yīng)曲面來判斷試驗(yàn)因素之間的交互作用強(qiáng)度以及確定各因素的最佳水平范圍。曲線越陡，說明因素間的交互作用越強(qiáng)；圖形中曲面顏色越深的區(qū)域，說明結(jié)果越顯著。

由圖2 可知：曲線比較陡，表明提取溫度（A）和液固比（D）之間的交互作用顯著；當(dāng)提取時間固定為2.5 h，乙醇濃度固定為65.0%，在提取溫度不變的條件下，液固比在20～50∶1 的范圍內(nèi)，隨著液固比值的升高，紅菜苔多酚提取量逐漸增加。

由圖3 可知：曲線很陡，近似直線，表明提取時間（B）和乙醇濃度（C）間的交互作用極顯著；當(dāng)提取溫度固定為45.5 ℃，液固比固定為35∶1 時，在提取時間不變的條件下，乙醇濃度值在50%～80%范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，紅菜苔多酚提取量逐漸增加，在65%附近達(dá)到最大值，隨后隨著乙醇濃度的增加，紅菜苔多酚提取量逐漸減少。

由圖4 可知：該曲線沒有圖2 和圖3 陡峭，但仍有一定的陡峭度，表明乙醇濃度（C）和液固比（D）間的存在著一定的交互作用；當(dāng)提取溫度固定為45.5 ℃，提取時間固定為2.5 h，在乙醇濃度不變的條件下，液固比在20～50∶1 的范圍內(nèi)，隨著液固比值的的升高，紅菜苔多酚提取量逐漸增加。

上述等高線和響應(yīng)曲面分析結(jié)果與表3 所示方差分析結(jié)果是一致的。

2.4 參數(shù)優(yōu)化與驗(yàn)證

R 的物理意義是每克紅菜苔皮和葉混合物提取多酚的毫克數(shù)，在Design Expert 7.0.0 軟件的優(yōu)化（optimization）模塊中，將優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為最大值，求解得R 的最優(yōu)值是1.529 3 mg/g，預(yù)測的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：溫度59.68 ℃，提取時間2.67 h，乙醇濃度64.60%，液固比53.57∶1（mL/g）。為檢驗(yàn)優(yōu)化條件的準(zhǔn)確性，按照上述優(yōu)化過的工藝參數(shù)，重復(fù)試驗(yàn)3 次，得其平均值為1.513 6 mg/g，與預(yù)測值相差1.027%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值基本吻合。

3 結(jié)論

1）經(jīng)過響應(yīng)曲面法擬合計(jì)算得出二次方模型的決定系數(shù)R-Squared 為0.968 2，校正系數(shù)RAdj=0.940 3，通過方差分析可對模型的精確性做進(jìn)一步的判斷，該模型的F 值為34.76，因誤差而接受該模型的概率不到0.000 1，具有較高的可信度，能夠?qū)t菜苔多酚的提取進(jìn)行預(yù)測和分析。

2）響應(yīng)曲面分析表明，提取溫度、乙醇濃度和液固比對紅菜苔葉和皮中多酚得率有極顯著的影響（P<0.01），計(jì)算得到的回歸方程為：R=-3.494 82-0.005 7A+0.398 9B+0.109 3C+0.037 1D+0.003 1AD-0.006 0BC-0.0002CD-0.0007C2-0.0004D2，決定系數(shù)為0.9573。

3）應(yīng)用響應(yīng)曲面分析法（RSA），確定從紅菜苔葉和皮中用乙醇浸提多酚的最優(yōu)提取條件為：提取溫度59.68 ℃，提取時間2.67 h，乙醇濃度64.60%，液固比53.57∶1（mL/g），預(yù)測最優(yōu)提取量是1.529 3 mg/g。用上述優(yōu)化過的工藝參數(shù)進(jìn)行提取，得其平均值為1.5136mg/g，與預(yù)測值相差1.027%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值基本吻合。這表明采用響應(yīng)面曲優(yōu)化的紅菜苔多酚乙醇浸提工藝，對于利用紅菜苔葉和莖皮提取多酚具有一定的指導(dǎo)意義。

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