苦瓜提取物健美功效評價及其安全性研究

劉曉英, 劉光榮, 朱晨瑜, 何聰芬,*, 祝 鈞

(1.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510665;2.北京工商大學(xué)北京市植物資源研究開發(fā)重點實驗室,北京 100048)

苦瓜(Momordica charantia L.)別名涼瓜、癩瓜、錦荔枝等,葫蘆科屬一年生蔓性草本植物.之所以呈甘苦味是因為其含有羅漢果苷和苦瓜素等成分[1].大量研究證明,苦瓜具有輔助降血糖、抗氧化、增強免疫力等功效[2-6],另外以苦瓜果汁對糖尿病大鼠進行治療可以使血清中非酯化膽固醇、磷脂及甘油三酯水平降低,高密度脂蛋白-膽固醇水平升高,趨于正常.進一步研究證明,苦瓜能夠減少甘油三酯分泌以及微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白的mRNA的表達(dá),是栽脂蛋白B的分泌以及甘油三酯的合成分泌的抑制劑,具有一定的預(yù)防肥胖的功效[7-9].對苦瓜提取物(由無限極有限公司提供)的健美功效及安全性進行研究.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜提取液,實驗中用蒸餾水或其他溶劑將苦瓜提取物配置為1.0,5.0,10.0,30.0,50.0 mg/mL溶液;雞血紅細(xì)胞,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級,北京梅里亞維通實驗動物有限公司;NaCl,甲醇,丙醇均為分析純,北京化學(xué)試劑公司;十二烷基硫酸鈉,分析純,北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;斑試器,圓形,直徑12 mm,北京北醫(yī)投資管理有限公司;L-抗壞血酸2-葡糖苷(ascorbic acid 2-glucoside,AA2G),原料級,北京貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司;豚鼠,原料級,北京軍事醫(yī)學(xué)院動物中心;W1002-2-500型甘油測定試劑盒,北京科達(dá)宏偉生物技術(shù)有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

4K15型冷凍離心機,美國Sigma公司;Purelab Vltra型超純水機,英國ELGA公司;UV2300型紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;FMe-100B型搖床,上海福瑪實驗設(shè)備有限公司;SMZ1000型解剖顯微鏡,日本NIKON公司;SHP-150型生化培養(yǎng)箱,上海森信實驗儀器有限公司;MINI-V/PCR型超凈工作臺,上海森信實驗儀器有限公司;FT-ZDQ型手提快速照蛋器,北京春明方通電子有限公司;MSE-1600型透皮吸收儀,天津市正通科技有限公司;SN151000377C型酶標(biāo)儀,美國Thermo Science Multiskan Go公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 功效性實驗

1.3.1.1 透皮吸收實驗

透皮吸收實驗參照文獻[10-11].向透皮吸收儀恒溫槽中加入適量水,開啟電源和恒溫槽磁力攪拌,設(shè)定恒溫槽中水溫為37士0.1℃.將制備好的鼠皮用鐵夾子固定在兩室擴散池之間,向垂直擴散池的接受池內(nèi)加入5.0 mL接受液,放入透皮吸收儀恒溫槽中預(yù)熱,設(shè)定接受池攪拌速度為700 r/min.向供給池內(nèi)分別加入供給液(即待測苦瓜提取液),以保鮮膜封住上口.開始記時,當(dāng)樣品滲透0.5,1,1.5,2,3,4 h時,分別取樣0.5 mL置具塞離心管中,在最大吸收峰處測量吸光度(實驗中測得苦瓜提取物在490 nm處出現(xiàn)最大吸收峰),計算透光量.累計透過量計算見公式(1).

式(1)中,Q為累積透過量,mg/cm2;S為透皮擴散面積,cm2;V1為Franz擴散池接受液體積,mL;ρn為第n次取樣時接受液的質(zhì)量濃度,mg/mL;ρi為第i次取樣時接受液的質(zhì)量濃度,mg/mL;V2為取樣量,mL.通過式(1)計算后,作出累積量與時間的曲線圖,及最終透過累積量.

1.3.1.2 促進脂肪分解能力實驗

按1 g/mL的比例加入制備好的脂肪底物與待測苦瓜提取液,37℃反應(yīng)2 h,取10 μL,加入190 μL工作液(甘油含量測定試劑盒內(nèi)含),37℃反應(yīng)10 min.550 nm下測透光值,將其帶入甘油含量標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算甘油增加量,依此分析脂肪被分解程度.

1.3.1.3 脂肪酸合酶抑制實驗

脂肪酸合酶抑制實驗參照文獻[12-14].將10 μL待測苦瓜提取液加入由1.8 mL磷酸緩沖液,25 μL 乙酰輔酶 A,50 μL 丙二酰輔酶 A,50 μL 還原型輔酶Ⅱ(triphosphopyridine nucleotide,NADPH)以及脂肪酸合酶組成的活性體系中,在340 nm下連續(xù)測定NADPH的質(zhì)量濃度變化,進而計算樣液對脂肪酸合酶的抑制作用情況.

1.3.2 安全性實驗

1.3.2.1 紅細(xì)胞溶血實驗

紅細(xì)胞溶血實驗參照文獻[15-16].用質(zhì)量比為0.1%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl-sulfate,SDS)檢測所采集紅細(xì)胞的完整性,同時在顯微鏡下觀察紅細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞膜的完整性.將樣品用磷酸鹽緩沖液(PBS)分別稀釋成待測質(zhì)量濃度,用其檢測樣品的刺激性.實驗分為2組:1)陽性對照組(0.1%SDS)和2)待測苦瓜提取液組.

1.3.2.2 雞胚絨毛尿囊膜實驗

雞胚絨毛尿囊膜實驗參照文獻[17-19].采用6 d齡雞胚放入(37.5 ±0.5)℃,相對濕度為60% ～80%的恒溫孵箱中孵育1 d,標(biāo)記、開窗放入無菌中速定性濾紙小片(直徑5 mm),然后用滅菌透明膠封口,培養(yǎng)24 h后,加待測苦瓜提取液(溶劑換為生理鹽水),設(shè)置0.1%的SDS為陽性對照組,生理鹽水為陰性對照組.加樣劑量為每次100 μL,每天1次,共3 d.實驗結(jié)束后,雞胚絨毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)用甲醇∶丙酮 =1 ∶1(v∶v)的固定液固定,用眼科鑷去掉CAM平面以上的卵殼及卵殼膜,完整剪下CAM,標(biāo)記藥膜中心點,拍照觀察.

1.3.2.3 人體斑貼實驗

人體斑貼實驗參照文獻[20-21].用待測苦瓜提取液浸潤濾紙后放入斑試器內(nèi),對照孔為空白對照(不置任何物質(zhì)).將樣品和空白對照均貼于受試者的前臂曲側(cè),用手掌輕壓使之均勻地貼敷于皮膚上,持續(xù)24 h,去除斑試器后間隔30 min,待壓痕消失后觀察皮膚反應(yīng).在除去斑試器48 h后再觀察一次皮膚反應(yīng).

2 結(jié)果與分析

2.1 功效性檢測結(jié)果

2.1.1 透皮吸收實驗

圖1 苦瓜提取物隨時間變化的累積透過量Fig.1 Cumulative penetration change with time of Momordica charantia extracts

樣品在不同質(zhì)量濃度下的透過累積量隨時間的增加均呈遞增趨勢,說明苦瓜提取物有透皮吸收效果(見圖1);隨質(zhì)量濃度的增加,樣品的透過率逐漸降低(見表1).綜合透過累積量與透過率2個因素得出,樣品起始質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時效果最佳.

表1 苦瓜提取物的透過率Tab.1 Transmittance of Momordica charantia extracts

2.1.2 促進脂肪分解能力實驗

苦瓜提取物能夠促進底物中的脂肪分解,使甘油含量上升,說明該提取物具有促進脂肪分解的能力,且隨質(zhì)量濃度的增高而增高(見圖2).但即使在最大質(zhì)量濃度50.0 mg/mL時也未達(dá)到50%.

圖2 苦瓜提取物促進脂肪分解能力實驗Fig.2 Experiment of promoting lipolysis of Momordica charantia extracts

2.1.3 脂肪酸合酶抑制實驗

結(jié)果顯示,苦瓜提取物對脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)有抑制作用,且隨著質(zhì)量濃度的加大,抑制作用加強,見圖3.說明苦瓜提取物能夠抑制脂肪的合成,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到50.0 mg/mL時FAS抑制率達(dá)到50.50%.

圖3 苦瓜提取物FAS抑制實驗Fig.3 Experiment of inhibiting fatty acid synthase of Momordica charantia extracts

2.2 安全性檢測結(jié)果

2.2.1 紅細(xì)胞溶血性實驗

按照RBC Test System方法中對結(jié)果的判定:若樣品溶血率高于20%,則判定為有刺激性,若低于則無刺激性.結(jié)果顯示,50.0,30.0 mg/mL的苦瓜提取物的溶血率較高,均大于界值20%,對紅細(xì)胞的刺激性較大;10.0,5.0,1.0 mg/mL樣液溶血率均低于20%,可判定無刺激性,見圖4.

圖4 苦瓜提取物紅細(xì)胞溶血性實驗實驗結(jié)果Fig.4 Red blood cell hemolysis test of Momordica charantia extracts

2.2.2 雞胚絨毛尿囊膜實驗

圖5是陰性對照組,各組雞胚大多數(shù)血管較少,甚至可見無血管區(qū)域.載體放置區(qū)域多為無血管區(qū)或血管較少的分布區(qū),可見雞胚血管細(xì)小,微血管生成較少.圖6是陽性對照組,雞胚已完全死亡.圖7a至圖7e為苦瓜樣液組,其中圖7a為加樣質(zhì)量濃度1 mg/mL組,與陰性對照組比較,血管數(shù)目略有增加,血管分支數(shù)也有所增加;圖7b為加樣質(zhì)量濃度5 mg/mL組,血管數(shù)目與分支數(shù)較1 mg/mL質(zhì)量濃度組進一步增加,分布較零亂;圖7c為加樣質(zhì)量濃度10 mg/mL組,較5 mg/mL組血管零亂程度加重,各藥物組CAM血管開始向載體生長集中;圖7d為加樣質(zhì)量濃度30 mg/mL組,較10 mg/mL質(zhì)量濃度組,血管管徑增寬,分布零亂無序,出現(xiàn)斷裂血管,且平行實驗中一只在距第一次加樣72 h后死亡;圖7e為加樣質(zhì)量濃度50 mg/mL組,可明顯看出溶血現(xiàn)象,且平行實驗中一只在距第一次加樣48 h后即死亡.綜上可見,苦瓜提取物的刺激性依質(zhì)量濃度的增加而增加,在低質(zhì)量濃度時刺激性較小,但是在高質(zhì)量濃度,如30,50 mg/mL時刺激性比較大,甚至?xí)霈F(xiàn)雞胚致死現(xiàn)象,見表2.

2.2.3 人體斑貼實驗

對苦瓜提取物進行人體斑貼實驗,結(jié)果見表3,此次實驗中苦瓜提取物斑貼實驗結(jié)果均符合《化妝品接觸性皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》的要求.

表2 苦瓜提取物對雞胚存活情況的影響Tab.2 Effect of Momordica charantia extracts on survival condition of chicken embryoes

圖5 陰性對照(生理鹽水)Fig.5 Negative contrast(normal saline)

圖6 陽性對照(0.1%SDS)Fig.6 Positive contrast(0.1%SDS)

圖7 不同質(zhì)量濃度苦瓜樣液的雞胚絨毛尿囊膜Fig.7 Different concentrations of Momordica charantia extracts for chicken embryo villus allantoic membrane

表3 苦瓜提取物人體斑貼實驗Tab.3 Patch test of Momordica charantia extracts

3 結(jié) 論

透皮吸收實驗證實,各質(zhì)量濃度的苦瓜提取物均能夠透過皮膚;促進脂肪分解能力實驗與脂肪酸和酶抑制實驗證實該提取物具有促進脂肪分解的能力與抑制脂肪合成的能力.體外安全性實驗——紅細(xì)胞溶血性實驗與雞胚絨毛尿囊膜實驗結(jié)果顯示苦瓜提取物在較低質(zhì)量濃度即1,5,10 mg/mL時安全無刺激;人體斑貼實驗結(jié)果顯示該提取物在任意檢測質(zhì)量濃度下對人體均無刺激性.經(jīng)過一系列的功效評價實驗和安全性研究,確定苦瓜提取物具有一定的健美功效,且在較低質(zhì)量濃度下安全無刺激,推薦選取10 mg/mL作為外用健美產(chǎn)品的添加量.

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