小分子封閉提高固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性

王 芬，陳飛飛，高為芳，杜方川，王安明，謝 恬

（1.杭州師范大學材料與化學化工學院，杭州311121；2.杭州師范大學生物醫(yī)藥與健康研究中心，杭州311121；3.杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，杭州311121）

小分子封閉提高固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性

王 芬1，2，陳飛飛1，2，高為芳2，杜方川1，3，王安明1，謝 恬2

（1.杭州師范大學材料與化學化工學院，杭州311121；2.杭州師范大學生物醫(yī)藥與健康研究中心，杭州311121；3.杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，杭州311121）

為了提高固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性，在制備共價固定化嗜熱菌蛋白酶的基礎上，通過選擇氨基酸和醇類小分子來封閉載體表面未反應的活化基團，并考察了固定化酶的催化活性及熱穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：L?Trp和L?Val封閉修飾固定化酶時，在80℃的水浴中加熱150 min后其剩余活力仍為93.4%和98.6%，其效果約為未經(jīng)小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶的2倍。所篩選的幾種小分子物質(zhì)中，叔戊醇、L?Trp、L?Val及L?Ala不僅能提高固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性，而且也可以提高固定化酶的相對活力，從而更有利于其在工業(yè)生產(chǎn)中的應用。

封閉；末端基團；固定化；熱穩(wěn)定性；嗜熱菌蛋白酶

天然酶穩(wěn)定性差、易失活、不能重復使用，并且在反應中易混入產(chǎn)品從而影響產(chǎn)品純度，使其難以在工業(yè)中有更為廣泛的應用。此外，酶的分離和提純以及一次性使用也大大增加了酶作為催化劑的成本。而固定化酶能夠改善酶的性質(zhì)，使酶具有更好的穩(wěn)定性和更高的使用效率，并且能夠回收利用，極大地節(jié)約了生產(chǎn)成本。但是固定化是將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，這對酶的結(jié)構(gòu)和活性帶來一定的影響。另外，周圍環(huán)境對酶也會產(chǎn)生一定的影響，不及體內(nèi)可以給酶提供一個最適的環(huán)境。

2007年，Jiang等［1］曾報道大分子可以提高酶的內(nèi)在催化活力，并且可以提高酶在溶液中的穩(wěn)定性。這是因為利用大分子可以模擬出類似于活性細胞中那種擁擠的微環(huán)境，也就是酶在體內(nèi)生存的微環(huán)境。但是很少有關于為固定化酶模擬一個細胞內(nèi)的微環(huán)境來提高酶在體外的一些性能的報道。因此近幾年來，越來越多的學者開始關注如何構(gòu)建一個微環(huán)境以便有利于固定化酶各項性能。Wang等［2］將大分子共價連接在MCFs載體上，模擬一個細胞內(nèi)的大分子擁擠環(huán)境，不但使青霉素?；D(zhuǎn)移酶的催化活力提高了1.8倍，而且最適反應溫度從45℃提高到了55℃。載體與酶的多點固定化方法也已經(jīng)有了諸多的報道［3-5］，其中，多點固定化使酶與載體可以更好的連接，明顯地提高固定化酶的負載率、催化活力和穩(wěn)定性。但是酶與載體之間的共價鍵越多，固定化酶并非就越穩(wěn)定，因為載體表面上多余的活性基團也有可能與酶產(chǎn)生一些不良反應，從而增加酶失活的可能性。

筆者采用小分子封閉的方法將載體表面上多余的活性基團去除，以提高酶的穩(wěn)定性，以期進一步提升和擴大該固定化酶的使用性能及范圍。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 試劑

嗜熱菌蛋白酶（50～100 U／mg）、α-甲基芐胺、聚（乙二醇）-block-聚（丙二醇）-block-聚（乙二醇）（P123），美國Sigma公司；脂肪酸甲酯磺酸鹽（MES）、脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；氟化銨、對苯醌、1，3，5-三甲苯（TMB）、正硅酸四乙酯（TEOS），國藥集團化學試劑有限公司；甲苯，衢州巨化試劑有限公司；硅烷偶聯(lián)劑JH-A112，鄭州市江漢精細化工有限公司；鹽酸乙二胺，阿拉丁公司；二乙胺，上?；瘜W試劑采購供應五聯(lián)化工廠。

1.1.2 儀器

恒溫振蕩器（水浴）（國華企業(yè)公司），蛋白分析儀（DU730）（Beckman Coulter公司）。

1.2 載體（MCFs?NH2）的制備

1.2.1 水熱過程

先稱取P123 5.34 g用水分批次溶解使其能全部轉(zhuǎn)移到容器中去，再加入61.34 mg氟化銨后開始攪拌，最后加入6.2 mL TMB和27.4 mL鹽酸（質(zhì)量分數(shù)36.5%）。設置攪拌轉(zhuǎn)速為250 r／min、40℃下攪拌45 min，然后加入12.6 mL TEOS，繼續(xù)攪拌20 h。攪拌完畢之后，將溶液轉(zhuǎn)入高壓反應釜中，置于烘箱中120℃老化24 h。最后用水過濾，烘干待用。

1.2.2 去模板反應

稱取上面所制的載體1.0 g于高壓反應釜中，加入10 mL濃HNO3（質(zhì)量分數(shù)65.5%）和7 mL雙氧水（質(zhì)量分數(shù)30%），置于烘箱中100℃反應12 h。然后用水洗滌過濾，烘干待用。

1.2.3 硅烷化

稱取4.5 g步驟1.2.2中制得的去模板載體于三口燒瓶當中，接著加入甲苯270 mL，氨基化試劑27 mL（硅烷偶聯(lián)劑JH-A112），再通冷凝水，油浴110℃加熱回流12 h，待反應結(jié)束后冷卻然后分別用甲苯和無水乙醇洗滌，待載體中的有機溶劑基本揮發(fā)之后，放入烘箱中烘干得MCFs?NH2，孔徑為26 nm。

1.3 載體的活化

稱取10 mg制備好的MCFs?NH2于反應瓶中，用3 mL 1.5 mmol／L的對苯醌溶液溶解，在25℃下，160 r／min的搖床中活化2 h。活化結(jié)束后，分別用20%（體積分數(shù)）乙醇和去離子水洗滌2次，放于4℃冰箱中備用。

1.4 嗜熱菌蛋白酶的固定化

整個反應體系為3 mL。將10 mg活化好的氨基化的MCFs載體重新分散于2.6 mL包含3 mol／L NaCl，20 mmol／L ZnCl2的pH 7.0、0.02 mol／L MES?NaOH的緩沖溶液中。將此載體液按每克MCFs?NH2中40 mg嗜熱菌蛋白酶（以自由酶計）的加酶量，加入1 mg／mL的嗜熱菌蛋白酶液0.4 mL，得到混合液?；旌弦涸僭?～7℃、40 W微波條件下照射3 min。

1.5 酶活的測定方法

先將1.5 mL 1.33%（100 mL溶液含1.33 g干酪素）的干酪素溶液和含10 mmol／L CaCl2、0.1 mol／L NaCl的40 mmol／L pH為7.5的Tris?HCl緩沖液0.3 mL置于圓底燒瓶中，37℃水浴中預熱2 min，然后加入0.2 mL孵育過的酶液，在恒溫振蕩器（水?。┲?7℃、160 r／min振蕩反應10min，往反應液中加2 mL終止液，繼續(xù)反應20 min。最后反應液用濾膜過濾，濾液在275 nm下測紫外吸收。空白對照是0.2 mL酶液（包含10 mmol／L CaCl2，0.1 mol／L NaCl的40 mmol／L pH為7.5的Tris?HCl緩沖液），其他操作同上。

1.6 熱穩(wěn)定性實驗

熱穩(wěn)定性以固定化酶剩余活力表示，剩余活力以熱處理后固定化酶活力與熱處理前的初始活力之比。

固定化酶的相對活力表示為

1）小分子封閉 將固定好的嗜熱菌蛋白酶分別移到小燒瓶中，往小燒瓶中分別加入100μL配制好的小分子溶液，使得它們的終濃度為3 mmol／L，然后將以上的混合液在恒溫培養(yǎng)搖床中25℃、160 r／min反應4 h。

2）固定化酶重新分散 反應結(jié)束后，小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶用固定化時所用的緩沖液洗滌3遍，洗滌液用考馬斯亮藍法（Bradford法）檢測其未固定上的蛋白含量。固定化酶用A液重新分散，稀釋132倍。

3）固定化酶孵育 將稀釋了132倍的酶液在80℃水浴中孵育不同時間后取出一定溶液進行酶活測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶失活和小分子封閉

為了提高酶的穩(wěn)定性，進一步提升和擴大固定化酶的使用性能及范圍，筆者采用小分子封閉的方法將載體表面上多余的活性基團去除，其酶失活和小分子封閉的過程及機制如圖1所示。

圖1 酶失活和小分子封閉的過程及機制Fig.1 Possiblemechanisms of enzyme deactivation and quenching excessive activated groups of imm obilized carriers

2.2 胺類封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

選擇鹽酸乙二胺、二乙胺和α-甲基芐胺作為胺類中的小分子對固定化嗜熱菌蛋白酶進行封閉，孵育條件為80℃水浴。其中，鹽酸乙二胺、二乙胺和α-甲基芐胺固定化酶的相對活力分別為72.6%、114.1%和118.4%。

圖2為胺類對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定的影響。由圖2可知：在前60 min內(nèi)，與無小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶活力相比，鹽酸乙二胺和α-甲基芐胺封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶活力下降的幅度減??；而二乙胺封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶活力下降的幅度較大。但在延長孵育時間后，有小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶活力下降的幅度反而增大。在80℃水浴中孵育150 min后，發(fā)現(xiàn)小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶幾乎都失去了催化活力。綜上可知，這3種胺類小分子物質(zhì)都不太適合用于固定化嗜熱菌蛋白酶。

圖2 胺類封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of am ine on thermal stability of immobilized thermolysin

2.3 二元醇封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

選擇不同的二元醇（乙二醇、戊二醇、己二醇）作為小分子物質(zhì)對固定化嗜熱菌蛋白酶進行封閉，孵育條件為80℃水浴，考察其對固定化嗜熱菌蛋白酶催化活性及熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖3。乙二醇、戊二醇和己二醇作為小分子對固定化嗜熱菌蛋白酶進行封閉4 h后，固定化嗜熱菌蛋白酶的活力均下降，分別使嗜熱菌蛋白酶的活力下降了27.8%、74.3%和47.9%。

圖3 二元醇封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of diol on thermal stability of immobilized thermolysin

由圖3可知：在80℃水浴中孵育30 min后，乙二醇封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶活力下降了20.9%；當孵育150 min后，其剩余活力僅20%。戊二醇使固定化嗜熱菌蛋白酶的活力下降趨勢更快，孵育120 min后，蛋白酶幾乎喪失活力。而己二醇，在孵育的前60 min內(nèi)，蛋白酶的活力保持不變，但是孵育90 min之后活力迅速降低；在孵育150 min時，固定化嗜熱菌蛋白酶催化活力僅保留了27.6%。

綜上所述，二元醇對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性有不利的影響。

2.4 一元醇封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性

的影響

選擇甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇和叔戊醇作為一元醇小分子對固定化嗜熱菌蛋白酶進行封閉，考察其對固定化酶活力的影響，不同的一元醇所對應的相對活力分別為57.0%、60.3%、27.2%、42.1%和100%?？梢?，幾種一元醇中，只有叔戊醇輔助的固定化酶的催化活力仍能保持游離酶的水平。

在此基礎上考察它們的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。由表1可知：叔戊醇封閉提高了固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性：在80℃水浴中孵育30 min后，叔戊醇封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶的催化活力僅下降了2.8%，而無小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶的催化活力卻下降了17%。孵育150 min后，叔戊醇封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶剩余催化活力仍為53.5%。并且與無小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶相比，叔戊醇封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶剩余活力整體下降趨勢更加緩慢。然而其他幾個一元醇小分子物質(zhì)封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶在80℃水浴中孵育30 min后活力喪失。由此可知，這幾個小分子物質(zhì)中，僅叔戊醇封閉對提高固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性有效。

表1 一元醇封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響Table 1 Effects of alcohol on thermal stability of immobilized thermolysin

2.5 芳香族氨基酸封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性影響

芳香族氨基酸封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性影響結(jié)果見圖4。由圖4可知：以L?Trp為小分子對固定化嗜熱菌蛋白酶進行封閉時，效果顯著。在80℃水浴孵育，2 h之內(nèi)L?Trp封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶的活力毫無下降，甚至孵育150 min后，其剩余活力仍為93.4%，由此可見，L?Trp封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶的耐熱性能有非常顯著的提高。且L?Trp封閉還提高了酶初始活力，L?Trp封閉后固定化嗜熱菌蛋白酶的相對活力為114.9%。

選擇的另一個芳香族氨基酸是苯丙氨基酸（L?Phe）。發(fā)現(xiàn)L?Phe封閉固定化嗜熱菌蛋白酶的相對活力為100%，其熱穩(wěn)定性，相比于無小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶來說，在80℃水浴中孵育60 min之前下降較小。但是延長孵育時間后，苯丙氨基酸封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶活力下降得更快，當孵育150 min后，其剩余活力為41.7%。因此相比較而言，L?Trp對固定化嗜熱菌蛋白酶的活力和熱穩(wěn)定性都有明顯提高，是嗜熱菌蛋白酶固定化過程中合適的小分子物質(zhì)。

圖4 芳香族氨基酸封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of aromatic am ino acid on thermal stability of immobilized thermolysin

2.6 脂肪族氨基酸封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響

分別用L?Ala、L?Gly、L?Ile、L?Leu和L?Val封閉后固定化嗜熱菌蛋白酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們所對應的相對活力分別為108.3%、98.8%、119.5%、106.4%和118.2%，這表明這些氨基酸都能保護載體表面的酶蛋白的結(jié)構(gòu)，能增強它們的催化活性。同時，部分脂肪族氨基酸（L?Ala、L?Gly、L?Ile、L?Leu和L?Val）封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性有顯著提高，結(jié)果見圖5。

由圖5可知：L?Val封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶有良好的熱穩(wěn)定性。在80℃水浴中孵育，2 h內(nèi)其催化活力基本沒有下降的跡象；在150 min后剩余活力仍為98.6%，約為無小分子封閉固定化嗜熱菌蛋白酶的2.0倍。而對于L?Ala封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶，在80℃下孵育時，其催化活力下降幅度不大，當孵育了150 min后，其剩余活力仍為90%，是無小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶催化活力的1.8倍。

圖5 脂肪族氨基酸封閉對固定化嗜熱菌蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of aliphatic am ino acid on thermal stability of immobilized thermolysin

與無小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶相比，L?Gly封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶在孵育過程中，蛋白酶的催化活力下降的速度較慢。L?Ile封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶在孵育的前30 min，活力下降得快；但在30～120 min內(nèi)，其活力下降的速度卻比無小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶要緩慢。至于L?Leu，前30 min內(nèi)對固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性基本沒有影響。

通過氨基酸小分子封閉的結(jié)果比較可以看出，固定化酶的熱穩(wěn)定性不僅是和載體表面的多余的活性基團有關，而且與載體表面的化學性能及微環(huán)境有關。小分子封閉過程中，小分子一方面封閉了未反應基團，另一方面不同的小分子修飾后改變了載體表面的物化性能和微環(huán)境，從而使得固定化酶表現(xiàn)出不同的熱穩(wěn)定性和催化性能。在前期的工作中發(fā)現(xiàn)，氨基酸類小分子適合于固定化青霉素?；傅奈捶磻鶊F封閉，而醇類分子適合固定化脂肪酶的未反應基團的封閉［2］。

綜上可知，L?Val與L?Ala是兩個效果較好的小分子，可以提高固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性，使其可以應用于比較苛刻的反應條件下。

3 結(jié) 論

1）叔戊醇可以提高固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性。在80℃水浴的孵育過程中，叔戊醇封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶活力下降的速度比無小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶的要慢。因此，叔戊醇是嗜熱菌蛋白酶催化合成阿斯巴甜前體反應常用的有機溶劑，這將為阿斯巴甜的合成提供良好的理論基礎。

2）芳香族氨基酸中L?Trp是比較合適的小分子物質(zhì)，可以很大程度提高固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)在80℃的水浴中孵育時，2 h之內(nèi)L?Trp封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶的活力毫無下降，甚至孵育150 min后其剩余活力仍為93.4%。

3）脂肪族氨基酸中L?Val和L?Ala都可以使固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性得到很大的提高，特別是L?Val封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶。當在80℃水浴中孵育時，2 h內(nèi)其催化活力基本沒有下降的跡象，150 min后剩余活力仍為98.6%，是無小分子封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶剩余催化活力的2倍；而L?Ala封閉的固定化嗜熱菌蛋白酶在80℃的高溫下孵育150 min后，其催化活力仍保留90%。

4）固定化酶的熱穩(wěn)定性不僅是和載體表面的多余的活性基團有關，而且與載體表面的化學性能及微環(huán)境有關。

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Enhancement of thermal stability of immobilized thermolysin using end?group blocking

WANG Fen1，2，CHEN Feifei1，2，GAOWeifang2，DU Fangchuan1，3，WANG Anming1，XIE Tian2

（1.College of Material，Chemistry and Chemical Engineering，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121，China；2.Research Center for Biomedicine and Health，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121，China；3.College of Biological and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121，China）

In order to enhance the thermal stability of the immobilized thermolysin，unreacted active end groups on the carrier surface were blocked with reagents such as amino acids and alcohols，after the thermolysin was covalently immobilized on the carrier.Both catalytic activity and thermal stability of the immobilized enzyme were investigated.The results showed thatafter heated at80℃in water for150 min，the residual activities of the immobilized enzymes blocked and modified by L?Trp and L?Val were about 93.4%and 98.6%，respectively，which was approximately 2 times higher than that of the immobilized thermolysin.Among the blocking reagents，tert?amyl alcohol，L?Trp，L?Val and L?Ala not only improved the thermal stability of immobilized thermolysin，but also enhanced the relative activity of the immobilized enzyme，thus itwasmore useful for its industrial application.

blocking；end group；immobilization；thermal stability；thermolysin

Q814.2

A

1672-3678（2013）06-0047-06

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.010

2012-08-31

國家自然科學基金（20906016，21076053）；教育部長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃（IRT1231）；浙江省自然科學基金（Y13B060058）；杭州市農(nóng)業(yè)科研攻關專項（20120232B13）

王 芬（1986—），女，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：天然藥物的化學酶法制備；王安明（聯(lián)系人），副研究員，E?mail：waming＠hznu.edu.cn