使用BODIPY熒光染料快速測定微藻油脂含量方法

劉亞男，姚長洪，2，周建男，孟迎迎，王海濤，2，曹旭鵬，薛 松

（1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連116023；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連116024）

使用BODIPY熒光染料快速測定微藻油脂含量方法

劉亞男1，姚長洪1，2，周建男1，孟迎迎3，王海濤1，2，曹旭鵬1，薛 松1

（1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連116023；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連116024）

使用BODIPY505／515熒光染料，通過熒光分光光度法測定藻細胞中的油脂含量。結(jié)果表明：BODIPY505／515的最佳染色條件為二甲基亞砜（DMSO）體積分數(shù)2%，BODIPY505／515最終質(zhì)量濃度0.25μg／mL，染色時間30 min，染色溫度35℃。在最佳染色條件下，微藻油脂含量與熒光強度呈線性相關(guān)（R2＝0.976 4）。通過測定BODIPY505／515染色的不同種屬微藻的熒光強度，應(yīng)用該關(guān)系計算其油脂含量，與質(zhì)量法測定的結(jié)果相比沒有顯著差異。該方法較為普適，比傳統(tǒng)方法相比具有簡便快捷，試樣用量少的特點，與尼羅紅熒光染料相比具有較窄的發(fā)射波譜范圍，不會與微藻的自身熒光相互干擾，更適于過程監(jiān)控及高含油藻株的篩選。

BODIPY；熒光；油脂；微藻

能源是經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的動力，而石化燃料資源的日益枯竭卻給全球經(jīng)濟的發(fā)展帶來了危機［1］。微藻作為一種潛在的可再生能源的生產(chǎn)者，具有光合效率高、生長速率快、生長周期短、單細胞油脂含量高和不占用耕地等優(yōu)點，在生物質(zhì)能源生產(chǎn)領(lǐng)域受到了越來越廣泛的重視［2］。

微藻藻種選育是生物柴油生產(chǎn)過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其中油脂含量是藻種篩選的重要指標(biāo)，選育富油藻種是規(guī)模化培養(yǎng)的前提條件［3］。快速、準(zhǔn)確、簡便的油脂含量測定方法不僅對富油藻種的篩選和生物柴油的生產(chǎn)極其重要，對微藻生物學(xué)的研究也具有十分重要的意義［4］。

質(zhì)量法是最為常用的微藻油脂測定方法，該方法準(zhǔn)確度高，但存在所需試樣量大、試樣處理與提取過程耗時長、使用有毒的有機溶劑提取、環(huán)境友好度差且測量成本較高的缺點。近年來，文獻［5-7］利用熒光染料特異性結(jié)合微藻中性脂油滴來分析油脂含量，以尼羅紅熒光染色法最為常見。這種方法能快速、靈敏地實現(xiàn)微藻中性脂的檢測，但是尼羅紅的發(fā)射光在590～640 nm范圍內(nèi)，與很多藻的自身葉綠素?zé)晒庀嗷ジ蓴_，導(dǎo)致不能準(zhǔn)確地進行檢測。因此，需要找到一種更為廣泛適用的能夠避免藻類自身熒光干擾的熒光染料。

BODIPY是一類近紅外的短波長熒光染料，常見的有BODIPY493／503、BODIPY500／510、BODIPY505／515、BODIPY530／550、BODIPY558／568，它們可以特異性地作用于中性脂組成的油滴，使得油滴可以被檢測，且其發(fā)射波長可以避開大部分藻自身葉綠素?zé)晒獾母蓴_［8］，目前，已有在流式細胞儀中使用BODIPY505／515進行產(chǎn)油微藻篩選的報道［9-10］，但流式細胞儀操作復(fù)雜，價格昂貴，不宜推廣。利用BODIPY染色可以在熒光顯微鏡下定性觀察微藻油脂積累的情況［11］，但還沒有利用該染料的熒光強度定量檢測微藻油脂含量的報道。

筆者以湛江等鞭金藻（Isochrysis zhangjiangensis）為實驗對象，利用BODIPY505／515對其中性脂進行染色，使用熒光分光光度計進行熒光強度的測定，考察該染料的最佳染色條件，并通過與傳統(tǒng)質(zhì)量法的比較，建立熒光強度與油脂含量的關(guān)系，將應(yīng)用到綠藻、硅藻等其他藻中，以實現(xiàn)熒光分光光度計快速檢測微藻油脂含量，為藻類培養(yǎng)的過程監(jiān)控及產(chǎn)油微藻的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種

海水藻：湛江等鞭金藻（Isochrysis zhangjiangen?sis）、亞心形四爿藻（Tetraselmis subcordiformis）、新月藻（Nitzschia closterium）、巴夫藻（Pavlova viridis）和牟氏角毛藻（Chaetocerosmuelleri），由遼寧海洋水產(chǎn)研究所提供。淡水藻：蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫（FACHB?Collection）。

1.1.2 培養(yǎng)基

海水藻培養(yǎng)基由來自大連附近海域的天然海水添加相應(yīng)的營養(yǎng)鹽組成，淡水藻培養(yǎng)基由去離子水添加相應(yīng)的營養(yǎng)鹽組成。

1）康維方營養(yǎng)鹽（1 L） NaNO3100 mg，NaH2PO4·2H2O 20.0 mg，EDTA?Na245.0 mg，H3BO333.6 mg，MnCl2·4H2O 0.36 mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 1.3 mg，ZnCl20.21 mg，CoCl2·6H2O 0.20 mg，（NH4）4Mo7O24· 4H2O 0.09 mg，CuSO4·5H2O 0.20 mg，KNO31 g，KH2PO40.05 g，Tris 0.81 g，CH3COOH 0.346 g，用于培養(yǎng)亞心形四爿藻。

2）f／2營養(yǎng)鹽（1 L） NaNO375 mg，NaH2PO4· 2H2O 5 mg，VB120.5μg，生物素（Biotin）0.5μg，VB10.1 mg，F(xiàn)eCl3·6H2O 3.16 mg，Na2EDTA·2H2O 4.36 mg，CuSO4·5H2O 9.8μg，Na2MoO4·2H2O 6.3μg，ZnSO4·7H2O 22μg，CoCl2·6H2O 12μg，MnCl2· 4H2O 0.18 mg，用于培養(yǎng)湛江等鞭金藻和巴夫藻。

3）f／2＋硅酸鈉營養(yǎng)鹽 上述f／2營養(yǎng)鹽添加Na2SiO330 mg／L，用于培養(yǎng)新月藻和牟氏角毛藻。

4）SE培養(yǎng)基（1 L） NaNO30.25 g，K2HPO4· 3H2O 0.075 g，MgSO4·7H2O 0.075 g，CaCl2·2H2O 0.025 g，KH2PO40.175 g，NaCl 0.025 g，F(xiàn)eCl3· 6H2O 0.005 g，EDTA?Fe 0.005 g，H3BO32.86 mg，MnCl2·4H2O 1.86 mg，ZnSO4·7H2O 0.22 mg，Na2MoO4·2H2O 0.39 mg，CuSO4·5 H2O 0.08 mg，Co（NO3）2·6H2O 0.05 mg，胰蛋白胨1 g，用于培養(yǎng)蛋白核小球藻。

1.1.3 儀器和試劑

Cary Eclipse熒光分光光度計（安捷倫公司），二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），BODIPY 505／515（4，4?difluro?1，3，5，7?tetramethyl?4?bora?3a，4adiazas?indacene，Invitrogen公司）。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

6株藻的培養(yǎng)條件相同：溫度（25±1）℃，光暗時間比14∶10，日光燈作光源。藻種培養(yǎng)于3 L錐形瓶中，光強為（50±5）μmol／（m2·s），培養(yǎng)至指數(shù)期接種使用。培養(yǎng)均在600 mL鼓泡式柱狀反應(yīng)器中完成，培養(yǎng)體積為500mL，光強（200±10）μmol／（m2·s），CO22%（體積分數(shù)），通氣速率100 mL／min，接種初始密度2×106個／mL。

1.2.2 測定方法

1）油脂含量的測定 使用正己烷對干燥的藻粉進行油脂的提取，稱取100 mg藻粉，加入2 mL正己烷進行總脂的提取，提取3遍，合并3次的提取液，N2吹掃至無溶劑后，烘干稱質(zhì)量即可測得油脂占干質(zhì)量百分比。

2）熒光強度的測定［12］使用熒光分光光度計的孔板閱讀模式進行測定，依次向96孔板中加入5 μL稀釋后的藻液，3μL一定濃度的BODIPY505／515熒光染料，292μL一定濃度的DMSO水溶液，共300μL體系，使藻液的終濃度保持在OD680值0.15左右，一定溫度下避光染色一定時間。選擇470 nm作為激發(fā)波長，測定在發(fā)射波長515 nm的熒光強度。

1.2.3 統(tǒng)計分析

用SPSS 16.0單因素方差分析（ANOVA）中的LSD多重比較進行數(shù)據(jù)差異性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 染料濃度對染色效果的影響

在不同的BODIPY最終質(zhì)量濃度條件下對藻細胞進行染色，分別考察BODIPY濃度對熒光強度的影響，每個濃度下有8個重復(fù)，結(jié)果見圖1。

由圖1可知：當(dāng)染料質(zhì)量濃度小于0.187 5 μg／mL時，熒光強度保持在135，多重比較顯示無顯著性差異（p＞0.05）。隨著染料濃度增加，熒光強度逐漸增加，到0.25μg／mL時達到2 171，此后增加染料濃度到1μg／mL，熒光強度無顯著增加（p＞ 0.05）。只有當(dāng)染料濃度增加到1.25μg／mL時熒光強度迅速增加到6 857，同時考慮到染色的靈敏度和染料用量，選擇最佳的染料終質(zhì)量濃度為0.25 μg／mL。

圖1 染料濃度對染色效果的影響Fig.1 Effects of dye concentrations on fluorescence intensity

2.2 染色溫度對染色效果的影響

在不同的溫度下對藻細胞進行染色，分別考察染色溫度對熒光強度的影響，染料終質(zhì)量濃度為0.25μg／mL，每個溫度下有8個重復(fù)，結(jié)果見圖2。

圖2 染色溫度對染色效果的影響Fig.2 Effects of staining tem peratures on fluorescence intensity

由圖2可知：在25～35℃的范圍內(nèi)，隨著染色溫度的升高，熒光強度逐漸升高，到35℃達到最大，這可能是因為溫度的升高有利于BODIPY進入細胞與油滴結(jié)合；之后熒光強度隨著溫度升高而迅速減小，可能是由于溫度過高會使熒光染料淬滅［13］。因此，選擇最佳染色溫度為35℃。

2.3 染色時間對染色效果的影響

為了獲得最優(yōu)的染色時間，考察染色時間對熒光強度的影響，染料終質(zhì)量濃度為0.25μg／mL，染色溫度為35℃。每個染色時間下有8個重復(fù)，結(jié)果見圖3。

圖3 染色時間對染色效果的影響Fig.3 Effects of staining time on fluorescence intensity

由圖3可知：染色效果隨染色時間的延長而增強，染色60 min以后熒光強度幾乎不變。在本實驗中，為了縮短染色時間而又能達到較好的染色效果，選擇30 min為后續(xù)的染色時間。

2.4 DMSO對熒光染料染色效果的影響

由于湛江等邊金藻沒有細胞壁，故使用其進行DMSO濃度對染色效果的促進實驗就沒有意義，本文在研究DMSO體積分數(shù)時僅選用了具有較厚細胞壁的綠藻——亞心形四爿藻。

在不同的DMSO的體積分數(shù)條件下對藻細胞進行染色，分別考察不同的DMSO濃度對藻細胞染色的熒光強度的影響，染料終質(zhì)量濃度為0.25μg／mL，染色溫度為35℃，染色30 min。每個體積分數(shù)下有8個重復(fù)，結(jié)果見圖4。

圖4 DMSO體積分數(shù)對染色效果的影響Fig.4 Effects of DMSO concentrations in BODIPY505／515 on fluorescence intensity

由圖4可知：DMSO體積分數(shù)的增加，對扁藻的染色效果有所加強，隨著DMSO濃度的增加，熒光強度也相應(yīng)地增加，當(dāng)DMSO的量從0.1%增加到2%時，相應(yīng)的熒光強度從375增加到446，當(dāng)DMSO體積分數(shù)增加到5%時，熒光強度更是增加到了474，比0.1%時增加了100。選擇DMSO添加的最終體積分數(shù)為2%。

DMSO能夠改變生物膜對電解質(zhì)、藥物和代謝產(chǎn)物的通透性，促進染料進入藻細胞［14］。Chen等［15］采用DMSO和微波輔助NR染色顯著提高了采用普通的染色方法不易染色的普通小球藻（Chlorella vulgaris）、假綠球藻（Pseudochlorococcum sp.）、雙形柵藻（Scenedesmus dimorphus）和若夫小球藻（Chlorella zofingiesis）的染色效果。

2.5 油脂含量與熒光強度的相關(guān)性

在以上優(yōu)化的染色條件下，根據(jù)熒光強度與對應(yīng)的油脂含量制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察其線性相關(guān)性，結(jié)果見圖5。

圖5 油脂含量與熒光強度的相關(guān)性Fig.5 Correlation of lipid content and fluorescence intensity

由圖5可知：在油脂含量11%～26%的范圍內(nèi)，油脂含量與熒光強度有較好的線性關(guān)系，R2＝0.976 4，并得到油脂含量與熒光強度的回歸方程y＝0.035x＋1.293 4（y為油脂含量，%；x為熒光強度），根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線方程來計算微藻油脂含量。

在質(zhì)量法中，正己烷由于其極性較弱，提取的主要是微藻的中性脂，如甘油三酯（TAG）、甘油二酯（DAG）、甘油一酯（MAG）和游離脂肪酸（FFA），而BODIPY熒光染料也主要是與中性脂組成的油滴結(jié)合才能在相應(yīng)的波長下發(fā)熒光［16］，因此用正己烷提取法測得的油脂含量與BODIPY熒光強度有較好的相關(guān)性。

2.6 熒光染料BODIPY505／515優(yōu)化的染色方法在其他藻上的應(yīng)用

對于不同的微藻，使用2.5中的回歸方程，根據(jù)測得的熒光值計算得到油脂占干質(zhì)量百分比，使用質(zhì)量法獲得的油脂含量進行比較，結(jié)果見圖6。

由圖6可知：除新月藻外，其余3株藻用熒光值計算的油脂含量與質(zhì)量法測定的油脂含量沒有顯著差異（p＞0.05）。因此，利用BODIPY熒光染料可以在較廣的微藻范圍（如硅藻、綠藻、金藻等多種藻類）內(nèi)快速、準(zhǔn)確測定油脂含量。同時，也可以應(yīng)用于培養(yǎng)過程油脂代謝監(jiān)控、藻種篩選等方面。

圖6 使用熒光值計算油脂含量與質(zhì)量法測定油脂含量比較Fig.6 Comparison of lipid contents in different algae species determ ined by fluorescencemethod and conventional gravimetric method（n＝3）

3 結(jié) 論

探索了利用BODIPY505／515熒光染料，通過熒光分光光度法測定藻細胞中的油脂含量的方法，確定了最適的染色條件，即染料質(zhì)量濃度為0.25 μg／mL，DMSO的體積分數(shù)為2%，在35℃下避光染色30 min。利用該方法可以較準(zhǔn)確地測定不同種屬的微藻細胞內(nèi)中性脂的含量，且具有不與微藻自身熒光相互干擾、試樣和熒光染料用量少、靈敏度高、操作簡便、可定量動態(tài)觀察細胞內(nèi)油脂積累情況等優(yōu)點，可應(yīng)用于培養(yǎng)過程油脂代謝監(jiān)控、藻種篩選等方面，將成為微藻油脂研究的有力工具。

［1］ 蔣曉菲，周紅茹，金青哲，等.微藻油脂提取技術(shù)的研究進展［J］.中國油脂，2012，37（10）：62?66.

［2］ Amaro H M，Guedes A C，Malcata F X.Advances and perspectives in using microalgae to produce biodiesel［J］.Appl Energy，2011，88（10）：3402?3410.

［3］ 楊忠華，李方芳，曹亞飛，等.微藻減排CO2制備生物柴油的研究進展［J］.生物加工過程，2012，10（1）：70?76.

［4］ 梁英，石偉杰，田傳遠.微藻總脂含量測定方法概述［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，42（5）：35?40.

［5］ 王金娜，嚴(yán)小軍，周成旭，等.產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動態(tài)積累過程的檢測［J］.生物物理學(xué)報，2010，26（6）：472?280.

［6］ 張敬鍵，呂雪娟，李愛芬，等.微藻細胞油脂含量的快速檢測方法［J］.中國生物工程雜志，2012，32（1）：64?72.

［7］ 林義，鐘添華，駱祝華，等.尼羅紅染色法篩選產(chǎn)油酵母及定量檢測細胞內(nèi)油脂含量的研究［J］.微生物學(xué)通報，2012，39（1）：125?137.

［8］ Haugland R P.Handbook of Fluorescent Probes and Reasearch Chemicals［M］.6thed.Eugene：Molecular Probes Inc.，1996：13?19.

［9］ Cooper M S，Hardin W R，Petersen TW，etal.Visualizing＂green oil＂in live algal cells［J］.J Biosci Bioeng，2010，109（2）：198?201.

［10］ Pereira H，Barreira L，Mozes A，et al.Microplate?based high throughput screening procedure for the isolation of lipid?rich marinemicroalgae［J］.Biotechnol Biofuels，2011，4（1）：61.doi：10.1186／01754?6834?4?61.

［11］ Ohsaki Y，Shinohara Y，Suzuki M，et al.A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets for fluorescencemicroscopy［J］.Histochem Cell Biol，2010，133（4）：477?480.

［12］ 薛松.一種使用BODIPY類熒光染料測定微藻油脂含量的方法：中國，201210442558.6［P］.2012?11?08.

［13］ Chen W，Zhang C，Song L，et al.A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae［J］.JMicrobiol Methods，2009，77（1）：41?47.

［14］ 王海英，符茹，黃寶祥.基于尼羅紅熒光染色的小球藻脂質(zhì)快速檢測方法研究［J］.中國油脂，2012，37（3）：78?81.

［15］ Chen W，Sommerfeld M，Hu Q.Microwave?assisted Nile red method for in vivo quantification of neutral lipids in microalgae［J］.JMicrobiol Methods，2011，102（1）：135?141.

［16］ Elle IC，Olsen L C，Pultz D，et al.Something worth dyeing for：molecular tools for the dissection of lipid metabolism in Caenorhabditis elegans［J］.FEBS Lett，2010，584（11）：2183?2193.

Rapid method for lipid content quantifiction ofm icroalgae based on BODIPY fluorescence

LIU Yanan1，YAO Changhong1，2，ZHOU Jiannan1，MENG Yingying3，WANG Haitao1，2，CAO Xupeng1，XUE Song1

（1.Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；3.School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China）

A method formicroalgae oil contentmeasurement based on fluorescent dye BODIPY505／515 is introduced.The optimum dyeing conditions for BODIPY505／515 were：BODIPY505／515 final concentration 0.25 g／mL with 2%DMSO，and dyeing at35℃for 30 min.Under optimal conditions，the correlation between oil content and fluorescence was built with R2＝0.976 4.Samples of four different species ofmicroalgae were tested by using the above optimal conditions，gravimetricmethod and Nile red fluorescence dye method.Compared with the gravimetric method，the advantages of the method were universal，simple，less sample required.Compared with the Nile red fluorescence dyes，BODIPY505／515 had narrow emission spectrum without the microalgal autofluorescence interference，more suitable foroleaginous algal strain screening and processmonitoring.

BODIPY；fluorescent；lipid；microalgae

Q949

A

1672-3678（2013）06-0068-05

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.014

2013-01-31

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）（2011CB200903）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2012AA052101）；中國科學(xué)院百人計劃（A1097）；遼寧省自然科學(xué)基金（2012010263）；中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所知識創(chuàng)新項目（K2010A3）；中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程領(lǐng)域前沿項目——大連化學(xué)物理研究所科研基金——青年基金

劉亞男（1982—），女，黑龍江雙鴨山人，碩士，助理研究員，研究方向：微藻生物能源；薛 松（聯(lián)系人），研究員，E?mail：xuesong＠dicp.ac.cn