共振瑞利散射測(cè)試血清蛋白酸堿度影響的探討

郭偉平，王 高，周漢昌

（中北大學(xué)儀器科學(xué)與動(dòng)態(tài)測(cè)試教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室電子測(cè)試技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原030051）

式中：I0為入射光強(qiáng)度，c為溶液的濃度，n為純?nèi)軇┑恼酃庵笖?shù)，λ0為激勵(lì)波長，NA為阿氏常數(shù)，λ為分子吸收帶中的任意波長，ε（λ）為所研究波長處的分子摩爾吸光系數(shù)，ε（λ0）為激勵(lì)波長處的分子摩爾吸光系數(shù)，Cv為光散射增加的卡巴納因子。在這里假設(shè)溶液發(fā)生變化時(shí)ε（λ）相同，就有

共振瑞利散射測(cè)試血清蛋白酸堿度影響的探討

郭偉平，王 高，周漢昌

（中北大學(xué)儀器科學(xué)與動(dòng)態(tài)測(cè)試教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室電子測(cè)試技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原030051）

提出了一種基于共振瑞利散射（RRS）原理測(cè)量人體血清蛋白的新方法。在緩沖溶液的作用下，把配制好的人體血清蛋白稀釋液按比例與四羧基酞菁鋅混合，經(jīng)過化學(xué)作用后在波長為400 nm左右藍(lán)色波段強(qiáng)光照射下，散射出480 nm左右的共振瑞利散射光強(qiáng)信號(hào)?？疾煸诓煌琾H對(duì)共振瑞利散射光強(qiáng)信號(hào)與混合物中的血清蛋白反應(yīng)線性關(guān)系的影響。結(jié)果表明，pH在6.0～8.0范圍內(nèi)混合溶液共振瑞利散射光強(qiáng)信號(hào)與血清蛋白的線性關(guān)系良好。

共振瑞利散射；血清蛋白質(zhì)；四羧基酞菁鋅

蛋白質(zhì)是一切生命活動(dòng)的重要基礎(chǔ)之一，其重要作用包括維持組織細(xì)胞的生長、更新和修補(bǔ)，參與多種重要的生理活動(dòng)。機(jī)體中血清蛋白包含的總蛋白、白蛋白、球蛋白的正常范圍分別為（60～80）、（40～55）和（20～30）mg／mL［1-2］。

共振瑞利散射（resonance Rayleigh scattering，RRS）是指當(dāng)瑞利散射位于或接近于物質(zhì)的分子吸收區(qū)時(shí)，電子的吸收光頻率與散射光頻率相同，電子在共振加劇的情況下吸收光波的能量并會(huì)產(chǎn)生散射光，這種吸收光并且再散射的過程稱為共振瑞利散射或共振增強(qiáng)性瑞利散射［3-5］。因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，逐漸用于蛋白質(zhì)濃度成分的分析。

本文中筆者利用酞菁化合物與蛋白質(zhì)溶液相結(jié)合并施加藍(lán)色波段激光照射激勵(lì)，能產(chǎn)生出一定范圍內(nèi)正比于蛋白質(zhì)濃度的共振瑞利散射強(qiáng)度的光信號(hào)，根據(jù)光強(qiáng)信號(hào)可以反推出蛋白質(zhì)混合溶液濃度［6-8］，并進(jìn)一步考察不同pH的混合溶液對(duì)實(shí)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，以期為其實(shí)際應(yīng)用提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

4-羧基鄰苯二甲酸酐，晶純實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；ZnCl2、鉬酸銨、尿素、丙酮，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水C2H5OH、NaOH、濃HCl，太原化肥廠化學(xué)試劑廠；上述試劑全為分析純?cè)噭ˋR）。

1.2 儀器

UV2300型紫外-可見分光光度計(jì)（大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司），傅里葉紅外光譜儀（德國Bruker公司），JJ-1型精密增力電動(dòng)攪拌器（常州澳華儀器有限公司），DZF-6020型真空干燥箱（鞏義市英峪予華儀器廠），加樣槍（美瑞泰克科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

當(dāng)用酞菁化合物與蛋白質(zhì)溶液相結(jié)合并施加藍(lán)色波段激光照射激勵(lì)時(shí)，將會(huì)產(chǎn)生出一定范圍內(nèi)正比于蛋白質(zhì)濃度的共振瑞利散射強(qiáng)度的光信號(hào)，由此根據(jù)光強(qiáng)信號(hào)可以反推出蛋白質(zhì)混合溶液濃度［6-8］。

在混有血清蛋白時(shí)產(chǎn)生的共振瑞利散射強(qiáng)度可表示為

式中：I0為入射光強(qiáng)度，c為溶液的濃度，n為純?nèi)軇┑恼酃庵笖?shù)，λ0為激勵(lì)波長，NA為阿氏常數(shù)，λ為分子吸收帶中的任意波長，ε（λ）為所研究波長處的分子摩爾吸光系數(shù)，ε（λ0）為激勵(lì)波長處的分子摩爾吸光系數(shù)，Cv為光散射增加的卡巴納因子。在這里假設(shè)溶液發(fā)生變化時(shí)ε（λ）相同，就有

而血清蛋白測(cè)試系統(tǒng)包括光學(xué)系統(tǒng)、機(jī)械系統(tǒng)和電路系統(tǒng)。光學(xué)系統(tǒng)主要由激光光源、準(zhǔn)直透鏡、試樣室、濾光片、聚光透鏡等組成，機(jī)械系統(tǒng)把激光器、試樣池和散射光接收單元有效固定在一起。電路系統(tǒng)主要由光電放大電路、信號(hào)處理電路、信號(hào)顯示電路組成。利用金屬酞菁化合物測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的總體框架示意見圖1。

圖1 血清蛋白測(cè)量裝置系統(tǒng)總體示意Fig.1 Schematic diagram of serum protein measurement system

散射光接受聚光透鏡將散射光信號(hào)匯聚到光電放大器的光電探測(cè)器上，通過低噪聲光電探測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電壓信號(hào)，再由運(yùn)算放大器進(jìn)行信號(hào)的第二級(jí)放大，變成幅值足夠大便于檢測(cè)、顯示的信號(hào)。微弱光信號(hào)檢測(cè)原理框如圖2。

圖2 微弱光信號(hào)檢測(cè)原理框Fig.2 Block diagram of detection principle of weak optical signal

由于本測(cè)試系統(tǒng)采集到的信號(hào)小，輸入信噪比較低，所以需要采用低噪聲高信噪比光電信號(hào)前置放大器（圖3）。電路部分包括電流／電壓前置放大電路、電壓放大電路、濾波電路和可調(diào)增益放大4部分［9］。

圖3 光電探測(cè)電路Fig.3 Photoelectric detection circuit

2 結(jié)果與討論

2.1 四羧基酞菁鋅的合成

將0.06 mol 4-羧基鄰苯二甲酸酐、10 molNaCl、0.1 mol鉬酸銨、0.5 mol尿素、10 mol ZnCl2混合，經(jīng)攪拌研磨后置于高溫爐（200℃）充分反應(yīng)3 h，然后取固體粉末與100 mL蒸餾水在燒杯中混合煮沸并過濾。將生成物加入至50 mL的20%（體積分?jǐn)?shù)）HCl溶液中。再將分離出來的固體依次用沸水、乙醇和丙酮洗滌，干燥。

將干燥后的產(chǎn)物加入NaOH溶液，水解10 h后用水稀釋反應(yīng)液，過濾除去不溶物，再用6 mol／L鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH≤3，靜置，得到絮狀沉淀，離心分離后，傾倒出上層清液，用沙漏抽濾，再用甲醇洗4～5次，真空干燥即得到產(chǎn)物四羧基酞菁鋅。

2.2 酸堿度對(duì)電壓值的影響

將試驗(yàn)系統(tǒng)按照?qǐng)D1搭建好后，依pH不同分3組將不同濃度的人血清蛋白溶液和酞氰化合物相混合，分別編號(hào)A、B和C。A組混合溶液為原始溶液，其pH固定，不受實(shí)驗(yàn)酸堿度影響；B組混合溶液加入HCl，并用pH試紙標(biāo)定不同酸度的混合液；C組混合溶液加入NaOH溶液，同理用pH試紙標(biāo)定不同堿度的混合溶液。得到3組不同pH下混合溶液的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用配制的1.0×10-2mol／L的四羧基酞菁鋅溶液，測(cè)量了5次數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1～表3。

表1 A組溶液實(shí)驗(yàn)測(cè)試電壓值Table 1 Experimental voltage data of a group solution

表2 B組溶液（酸性溶液）對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試電壓值的影響（pH＜7）Table 2 Effects of B solution（pH＜7）on experimental voltages

表3 C組溶液（堿性溶液）對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試電壓值的影響（pH＞7）Table 3 Effects of C solution（pH＞7）on experim ental voltages

2.2.1 中性環(huán)境

從A組數(shù)據(jù)得到不同濃度的血清蛋白濃度和電壓值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，結(jié)果如圖4所示。擬合得到不同濃度下1.0×10-2mol／L的四羧基酞菁鋅溶液反應(yīng)線性關(guān)系，見式（3）。

圖4 1.0×10-2mol／L的四羧基酞菁鋅A組溶液數(shù)據(jù)擬合曲線Fig.4 Solution fitting data curve of Zn（Ⅱ）?tetracarboxy?phthalocyanine（solution A）

2.2.2 酸性環(huán)境

從表2可知，隨著混合溶液酸度增強(qiáng)，探測(cè)到電壓值急劇變化，原因在于四羧基酞菁鋅是配陽離子，酸性太高破壞了離子締合反應(yīng)的進(jìn)行，嚴(yán)重破壞了混合溶液的介質(zhì)穩(wěn)定性，在pH 4.0時(shí)幾乎得不到信號(hào)輸出。

2.2.3 堿性環(huán)境

從表3數(shù)據(jù)可知，隨著堿度的增加，表中的電壓輸出仍然趨于穩(wěn)定，只是在pH（10.0）時(shí)混合溶液的輸出電壓才開始出現(xiàn)一定跳變。

3 結(jié) 論

采用醫(yī)用微量加液槍準(zhǔn)確加取混合液，排除人為偶然因素對(duì)系統(tǒng)帶來的誤差。經(jīng)過反復(fù)多次試驗(yàn)，最后在以1.0×10-2mol／L的四羧基酞菁鋅溶液作為試樣液時(shí)，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.969 1。而在酸性影響的情況下，混合溶液離子合成受到影響，共振瑞利散射條件被破壞，測(cè)試系統(tǒng)失去穩(wěn)定性，相反堿性條件對(duì)溶液大分子離子的合成沒有必然的影響。該測(cè)量系統(tǒng)完成了準(zhǔn)確、快速測(cè)量人血清蛋白的目的，完成了探討酸堿度對(duì)共振瑞利散射測(cè)量人血清蛋白影響的工作。

［1］ 馮巧玲，王高，雷樹峰，等.基于半導(dǎo)體激光器的人血清蛋白濃度測(cè)量［J］.激光技術(shù)，2013，37（1）：68?71.

［2］ 王高，馮巧玲，薛忠晉，等.基于共振瑞利散射血清蛋白濃度檢測(cè)的研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析.2013，33（3）：752?755.

［3］ Bolleter W T，Bushman C J，Tidwell P.Spectrophotometric determination of ammonia as indopHenol［J］.Anal Chem，1961，33（4）：592?599.

［4］ 李德堯.GaN基藍(lán)紫光激光器研究［D］.北京：中國科學(xué)院半導(dǎo)體研究所，2006.

［5］ 劉紹璞，劉忠芳.離子締合物二級(jí)散射光譜的分析應(yīng)用［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，1995，53（12）：1178?1183.

［6］ 姜帆，胡瓊，姜船.C反應(yīng)蛋白在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8（2）：254?256.

［7］ 董作亮.POCT的研究進(jìn)展［J］.國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2003，24（3）：164?166.

［8］ Liu JF，Li N B，Luo H Q，et al.Resonance Rayleigh scattering，second?order scattering and frequency doubling scattering spectra for studying the interaction of erythrosine with Fe（phenand its analytical application［J］.Spectrochim Acta A：Mol Biomol Spectrosc，2011，79（3）：631?637.

［9］ 王媚，韓權(quán)，楊曉慧，等.共振瑞利散射法測(cè)定人體尿液和血漿中氟羅沙星［J］.分析試驗(yàn)室，2010，29（11）：65?68.

M easurement of human serum album in based on resonance Rayleigh scattering at different pH

GUOWeiping，WANG Gao，ZHOU Hanchang

（National Key Laboratory of Electronic Measurement Technology，Key Laboratory of Instrumentation Science＆Dynamic Measurement of the Ministry of Education，North University of China，Taiyuan 030051，China）

A method for measuring human hemoglobin by resonance Rayleigh scattering（RRS）was constructed.In buffer solution human hemoglobin and Zn（Ⅱ）?tetracarboxy?phthalocyanine solution was irradiated by 400 nm light.It could scatter resonance Rayleigh scattered light intensity signal of about480 nm.The linear relation between the resonance Rayleigh scattering light intensity signal and the hemoglobin concentration was established at pH 6.0?8.0.

resonance Rayleigh scattering；serum protein；Zn（Ⅱ）?tetracarboxy?phthalocyanine

TN247

A

1672-3678（2013）06-0078-04

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.016

2013-01-18

國家自然科學(xué)基金（20576055）

郭偉平（1987—），男，山西長治人，碩士研究生，研究方向：光電傳感技術(shù)及電子測(cè)試；王 高（聯(lián)系人），副教授，E?mail：jaydanny2006＠163.com