卡介苗各亞株間Rv1985c和Rv1986基因缺失的研究

張 雯 張媛媛 陳 晨*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所生物信息室，北京 102206）

卡介苗各亞株間Rv1985c和Rv1986基因缺失的研究

張 雯 張媛媛 陳 晨*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所生物信息室，北京 102206）

目的明確卡介苗群體內(nèi)在Rv1985c和Rv1986兩個(gè)位點(diǎn)上的遺傳差異。方法基于結(jié)核分枝桿菌設(shè)計(jì)引物，針對(duì)21株卡介苗標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株進(jìn)行Rv1985c和Rv1986兩個(gè)位點(diǎn)的PCR鑒定，鑒定基因的缺失情況。結(jié)果21株卡介苗中10株缺失Rv1985c基因，11株缺失Rv1986基因。結(jié)論卡介苗中部分菌株中兩個(gè)基因位點(diǎn)的缺失，為今后的疫苗改造提供了備選位點(diǎn)，同時(shí)本研究中所建立的PCR方法也可以在臨床上用于部分卡介苗菌株與結(jié)核分枝桿菌的快速鑒別。

結(jié)核；卡介苗；缺失；Rv1985c；Rv1986

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）危害人類健康已有數(shù)千年之久，曾被稱為人類的白色瘟疫[1]?？ń槊纾˙acille Calmette Guérin，BCG），是目前世界上唯一獲準(zhǔn)用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，于1921年由法國(guó)科學(xué)家卡爾梅特（Calmette）和介朗（Guérin）研制成功?？ń槊缡峭ㄟ^將牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）在甘油膽汁馬鈴薯培養(yǎng)基上歷經(jīng)13年（1908～1921年）長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代，最終得到的減毒菌株。這種減毒菌株，喪失了對(duì)人類的致病能力，但仍保持有較高的免疫原性，成為了可預(yù)防結(jié)核病的卡介苗疫苗[2]。在中國(guó)，卡介苗已被列為國(guó)家計(jì)劃免疫疫苗之一，嬰兒出生后立即接種，因此又被稱為“出生第一針”。在英國(guó)、印度、巴西等其他國(guó)家卡介苗也都廣泛推行。目前，卡介苗總免疫覆蓋率近乎覆蓋了世界人口的80%[3]，每年約有一億兒童接種卡介苗，是人類歷史上使用最多的疫苗。自1921年研發(fā)成功后，卡介苗被許多國(guó)家相繼引入并應(yīng)用于臨床，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下傳代，最終產(chǎn)生分布于世界各個(gè)地域的BCG亞株，如BCG-Pasteur、BCG-Tokyo等[4]。眾多的BCG亞株在形態(tài)、生化特征和免疫效應(yīng)差異等方面都具有顯著差異[5]。例如，BCG-Glaxo和BCG-Danish在英國(guó)的免疫保護(hù)作用高達(dá)60%～80%[6，7]。在美國(guó)南部的卡介苗亞株的免疫效率僅有14%[8]。明確卡介苗各株間的遺傳差異，了解卡介苗的遺傳背景，篩選針對(duì)特定人群的最優(yōu)疫苗，是疫苗使用和改造的基礎(chǔ)。

近三十年來，卡介苗的各種缺陷逐漸顯現(xiàn)[9]。大量臨床統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，卡介苗平均預(yù)防保護(hù)率僅在50%左右[6]，其有效性需要進(jìn)一步提高。另一方面，目前卡介苗的適用人群有限?？ń槊鐑H能有效保護(hù)兒童預(yù)防結(jié)核病（＞80%），對(duì)青少年和成人的效果則很弱[3]。卡介苗各亞株針對(duì)不同人群也具有顯著的效應(yīng)差異[10]。如BCG-Glaxo和BCG-Danish在英國(guó)的免疫保護(hù)作用高達(dá)60%～80%，但越接近赤道，效果愈差[6，7]。在美國(guó)南部的卡介苗亞株的免疫效率僅有14%[8]。由于目前世界上唯一可應(yīng)用的抗結(jié)核病疫苗卡介苗在有效性和普適性方面缺陷明顯，因此對(duì)卡介苗進(jìn)行改造，開發(fā)新的高效安全的結(jié)核病疫苗，是目前結(jié)核病預(yù)防控制工作的重要內(nèi)容和保障人民健康安全的迫切需求，而對(duì)卡介苗的遺傳背景的了解，特別是針對(duì)與免疫原性密切相關(guān)的抗原表位遺傳背景的研究，是疫苗改造的前提和基礎(chǔ)。

本研究中針對(duì)Rv1985c和Rv1986這兩個(gè)涵蓋多個(gè)抗原表位的基因，在卡介苗群體內(nèi)進(jìn)行多態(tài)性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了其在多個(gè)卡介苗亞株中的缺失現(xiàn)象，再次從分子生物學(xué)角度上證實(shí)了卡介苗各株間的遺傳差異，為不同卡介苗間的效應(yīng)差異提供了解釋，為今后新型抗結(jié)核疫苗研制提供了線索。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

來源于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌種庫(kù)的13株卡介苗標(biāo)準(zhǔn)株和收集于中國(guó)各地的8株卡介苗臨床株，以及1株結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv。

1.2 PCR方法

采用CTAB法從菌株中分別提取核酸做為PCR反應(yīng)模板。基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上得到Rv1985c和Rv1986核苷酸序列分別設(shè)計(jì)引物 （Rv1985cF：5’ GAAATGCGCTACCTACCAGTG 3’；Rv1985cR：5’GTGAACCCGTCGGATAGATG 3’；Rv1986F：5’ACCGTCGTGTTGCTAGGC 3’；Rv1986R：5’ATACCGCACTGGCTGTGAC3’）。 94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，1%瓊脂糖凝膠電泳確定PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度。

2 結(jié) 果

本文基于常規(guī)PCR方法檢測(cè)出Rv1985c和Rv1986兩個(gè)基因在卡介苗群體里的遺傳多態(tài)性。結(jié)核分枝桿菌H37Rv所擁有的這兩個(gè)基因，在21株卡介苗標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株中并非普遍存在。21株卡介苗中僅有11株含有Rv1985c基因，10株含有Rv1986基因（圖1）。8株BCG臨床菌株中，西安BCG也被發(fā)現(xiàn)缺失這兩個(gè)基因。該結(jié)果再次證實(shí)了，卡介苗各亞株間存在顯著的遺傳差異。由于Rv1985c和Rv1986含有了結(jié)核分枝桿菌中抗原表位60540、1150、24522和25123。

圖1 PCR結(jié)果

M1 2 3 4 5 678 MarkerBirkhaug China Danish Frappier Glaxo Japan MoreauPasture Rv1985c - + - - - - - -Rv1986 - + - - - - - -Marker Phipps Pragure Russia Sweden Tice FJ07113FJ06111FJ06050 Rv1985c - - + + + + + + Rv1986 - - + + - + + + MarkerJL06395HN04129HN04200GX06088西安BCGH37RvddH2O Marker Rv1985c + + + + - + Rv1986 + + + + - +

3 討 論

本研究說選用的菌株具有一定的代表性，不僅采用13株來自于世界各國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)株，同時(shí)也采用了8株來自于中國(guó)不同地區(qū)的BCG臨床株，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了不同卡介苗標(biāo)準(zhǔn)株之間確實(shí)存在遺傳差異，即使是同屬中國(guó)臨床株的8株BCG菌株間也存在差別。

卡介苗不同亞株間遺傳差異的鑒定，特別是部分菌株內(nèi)含有重要抗原表位的2個(gè)基因（Rv1985c和Rv1986）的缺失，可以從分子生物學(xué)水平上解釋不同BCG效應(yīng)差異的問題?？ń槊缰锌乖砦坏膩G失和遺傳突變的產(chǎn)生，通過影響基因的表達(dá)水平和改變蛋白的空間結(jié)構(gòu)，引起卡介苗各亞株的免疫效率差異[10]?？乖砦唬‥pitopes）是蛋白抗原分子表面能夠決定抗原特異性的數(shù)個(gè)氨基酸殘基組成的特殊序列及空間結(jié)構(gòu)，是蛋白抗原上引起機(jī)體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵部位，在抗原發(fā)揮免疫學(xué)功能時(shí)起到?jīng)Q定作用。據(jù)國(guó)際免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)（IEDB）統(tǒng)計(jì)，目前已被鑒定的結(jié)核分枝桿菌中的抗原表位已有3641個(gè)。相較于結(jié)核分枝桿菌，卡介苗在培養(yǎng)分化過程中發(fā)生了大量的抗原表位的丟失和單核苷酸點(diǎn)突變[11]，這些發(fā)生遺傳變異的抗原表位與卡介苗的免疫效率相關(guān)，有望成為研制新型疫苗的靶分子，被用于抗結(jié)核新型重組疫苗和表位疫苗的開發(fā)。如ESAT-6中含有多個(gè)T淋巴細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位[12]，是結(jié)核菌短期培養(yǎng)濾液蛋白中一種特異的蛋白抗原，僅存在于致病性結(jié)核桿菌中，在卡介苗菌株中丟失，不表達(dá)ESAT-6蛋白[13]。Pym等的研究結(jié)果表明，擁有ESAT-6中部分抗原表位的重組疫苗（BCG：RD1-2F9）在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出比BCG更強(qiáng)的免疫保護(hù)力。因此，明確卡介苗中所丟失的抗原表位和抗原表位上的多態(tài)性位點(diǎn)是新型疫苗構(gòu)建工作開展的首要任務(wù)，基于抗原表位的重組疫苗和表位疫苗的構(gòu)建也是目前新興抗結(jié)核疫苗研制的熱點(diǎn)之一?？ń槊缛后w內(nèi)部分菌株2個(gè)基因（Rv1985c和Rv1986）的缺失，為今后進(jìn)一步改造卡介苗，提供了可供改造的位點(diǎn)，同時(shí)也可以作為鑒別不同亞株的靶標(biāo)位點(diǎn)，有效運(yùn)用于臨床，對(duì)致病的結(jié)核分枝桿菌和部分卡介苗亞株進(jìn)行鑒別。

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Deletion of Two Genes of Rv1985c and Rv1986 in Several BCG Strains

ZHANG Wen, ZHANG Yuan-yuan, CHEN Chen

(Institute of Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, P. O. Box 5, Beijing 102206, China)

ObjectiveTo clear BCG group on genetic differences in the inner Rv1985c and Rv1986 two of sites.MethodIdentified by PCR primers were designed based on Mycobacterium tuberculosis, BCG for 21 standard strains and clinical isolates Rv1985c and Rv1986 two of sites identified gene deletion.Result21 BCG 10 missing Rv1985c gene, 11 missing Rv1986 gene.ConclusionSome strains of BCG in the two loci lack of alternative sites for future vaccine transformation, PCR method established in this study can be used in the clinical part of the BCG strain of Mycobacterium tuberculosisrapid identification.

Tuberculosis; BCG; Deletion; Rv1985c; Rv1986

R52

B

1671-8194（2013）15-0001-02

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（課題編號(hào)81201322）和艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治重大專項(xiàng)（課題編號(hào)2013ZX10003006-002）資助

*通訊作者：E-mail： chenchen@icdc.cn