cAMP紅曲霉藍光誘導(dǎo)途徑中的作用

楊 華, 陳勉華, 王 婧, 馬博雅, 張曉偉, 王昌祿

(天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室/食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

藍光可以通過多種途徑影響真菌代謝及生長.在粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)中，藍光可以影響其蛋白質(zhì)磷酸化作用，生物鐘節(jié)律變化，菌落形態(tài)以及產(chǎn)孢等生理過程[1]，對粗糙脈孢菌的胡蘿卜素合成以及次生代謝合成關(guān)鍵基因veA和fluG也有影響[2-3].除粗糙脈孢菌外，布拉氏須霉(Phycomyces blakesleeanus)、互生鏈格孢子菌(Alternaria alternata)的色素代謝，黑曲霉(Aspergillus niger)中的葡萄糖苷酶合成以及菌絲形態(tài)、孢子生殖都受藍光影響[4-7].

光照作為重要的環(huán)境信號因子，可以影響真菌細胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和腺苷-3′，5′-環(huán)化一磷酸(cAMP)的水平以及蛋白的磷酸化等[8-10].cAMP是細胞內(nèi)的第二信使，cAMP信號途徑是感受環(huán)境改變的重要途徑:當細胞受到外界刺激時，細胞膜上的Gs-蛋白被激活，然后再激活細胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶，催化ATP脫去一個焦磷酸形成cAMP，cAMP通過激活cAMP依賴性蛋白激酶，使靶細胞蛋白磷酸化，進而調(diào)節(jié)細胞反應(yīng)，產(chǎn)生一系列的生理變化.cAMP途徑是藍光轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要組成部分可以調(diào)節(jié)真菌很多生理功能，如粗糙脈孢菌以及一些曲霉產(chǎn)孢，黑曲霉的次生代謝等[11-12].

紅曲霉是中國傳統(tǒng)藥食兼用菌種，可代謝產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，廣泛用于釀酒、制藥等領(lǐng)域[13]，但因其代謝產(chǎn)物——桔霉素的存在，限制了紅曲霉的應(yīng)用.桔霉素是一種腎毒素，還具有致畸、致突變作用.目前，對桔霉素調(diào)控研究多集中于培養(yǎng)基的優(yōu)化及產(chǎn)毒關(guān)鍵基因的敲除.但優(yōu)化培養(yǎng)基并不能從根本上去除桔霉素，敲除產(chǎn)毒關(guān)鍵基因往往導(dǎo)致紅曲霉代謝產(chǎn)物中其他生物活性成分產(chǎn)量減少.采用環(huán)境因子調(diào)控真菌代謝是一種行之有效的調(diào)控方法，尤其近年來發(fā)現(xiàn)藍光可以調(diào)節(jié)紅曲霉次生代謝產(chǎn)物——桔霉素、紅曲色素以及Monacolin K產(chǎn)量以及孢子生成[14-15]，但具體的調(diào)控機理還未知.

為研究藍光對紅曲霉代謝及產(chǎn)孢調(diào)控機理，尤其是cAMP在藍光調(diào)控中的作用，本文通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加能夠促使紅曲霉菌生成cAMP的氨茶堿，提高紅曲霉細胞內(nèi)cAMP水平，進而觀察cAMP對紅曲霉次生代謝及產(chǎn)孢影響，結(jié)合藍光照射對紅曲霉次生代謝及產(chǎn)孢影響，探討cAMP在紅曲霉藍光誘導(dǎo)途徑中的作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

橙色紅曲霉(M.aurantiacus)MX1系天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)實驗室保藏.該菌種屬高產(chǎn)桔霉素菌種，對外部環(huán)境較敏感，有利于研究紅曲霉桔霉素代謝調(diào)節(jié)和外部環(huán)境對其代謝及表型影響.菌種接種于PDA培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)96 h后，保存于4℃冰箱中，每月轉(zhuǎn)接活化一次.

1.1.2 試劑

氨茶堿購自Sigma公司;酵母膏購自O(shè)xoid公司;其他用作培養(yǎng)基配制試劑均為分析純，購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;高效液相檢測用甲醇、乙腈為色譜純，購自Merck公司.

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為大米粉 30 g，KH2PO42.5 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 1 g 溶于 1 000 mL H2O 中，乳酸調(diào)pH至4.5.

YES培養(yǎng)基為蔗糖和酵母浸膏分別滅菌后混合.蔗糖質(zhì)量濃度為160 g/L，酵母浸膏質(zhì)量濃度為40 g/L.

PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200 g切成小塊，水煮20 min，過濾后將H2O補足至1 000 mL，加入葡萄糖20 g，瓊脂 20 g.

以上培養(yǎng)基滅菌條件為121℃，20 min.

1.2 儀器與設(shè)備

1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;TES133型專業(yè)級照度計，泰仕電子工業(yè)股份有限公司.

1.3 方 法

1.3.1 菌種培養(yǎng)方法

在活化的MX1菌種斜面中加入5 mL無菌水，用孢子鏟將斜面上的孢子刮下，制成孢子懸液，倒入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃，180 r/min培養(yǎng)30 h，得到種子液.

將上述種子液用無菌紗布過濾，血球計數(shù)板計數(shù)，用無菌水將孢子懸液濃度調(diào)整到106個/mL.取3 mL種子液，加入裝有50 mL YES培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃靜置培養(yǎng)8 d.

為檢測藍光及氨茶堿對紅曲霉MX1代謝產(chǎn)生桔霉素和產(chǎn)孢的影響，將樣品分為三組，分別放置在黑暗、藍光照射(470 nm，130 lx)以及在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的氨茶堿進行培養(yǎng)，用血球計數(shù)板進行孢子計數(shù).

1.3.2 桔霉素檢測方法

樣品預(yù)處理方法是用移液管量取1 mL紅曲霉MX1發(fā)酵液，放入離心管中，加5 mL蒸餾水，再加無水乙醇12 mL，攪拌均勻，放入60℃水浴中加熱1 h，每隔20 min振蕩一次，然后以3 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜過濾，用于HPLC分析.

高效液相色譜條件是安捷倫C18型色譜柱(4.6 mm×250 mm，粒度5 μm);流動相為V(乙腈):V(甲醇):V(水)=70:10:20，pH 2.5(用磷酸調(diào));檢測器為熒光檢測器，檢測波長為λex=331 nm，λem=500 nm;柱溫為28℃;流速為1 mL/min.

2 結(jié)果與分析

2.1 氨茶堿對紅曲霉菌落的影響

將紅曲霉孢子懸液涂布到含有不同濃度氨茶堿的PDA平板上，37℃培養(yǎng)5 d，其結(jié)果如圖1.

圖1 不同濃度的氨茶堿對紅曲霉MX1菌落的影響Fig.1 Effects of different concentrations of aminophylline on the colony morphology of Monascus MX1

從圖1可以看出，氨茶堿的添加對紅曲霉菌落及生長有顯著影響，從左到右添加氨茶堿至終濃度依次為 0，5，10，15，20 mmol/L. 當氨茶堿添加量小于等于10 mmol/L時，隨著氨茶堿添加量的增加，MX1菌落越來越小，越來越密集，顏色也越來越紅.由于紅曲色素是在紅曲霉生長的中后期產(chǎn)生的，因此可以推斷低濃度的氨茶堿可以促進紅曲霉生長.當氨茶堿添加量大于10 mmol/L時，MX1菌落越來越稀疏，這說明高濃度的氨茶堿能夠抑制紅曲霉生長.

2.2 藍光及氨茶堿對紅曲霉產(chǎn)孢的影響

分別在YES培養(yǎng)基中添加氨茶堿至終濃度為0，5，10，15，20 mmol/L 黑暗條件下培養(yǎng)紅曲霉 MX1 5 d，以及藍光照射條件下培養(yǎng)紅曲霉MX1 5 d，對發(fā)酵液中紅曲霉MX1分生孢子及子囊孢子數(shù)進行分析，結(jié)果如表1.

表1 藍光誘導(dǎo)和氨茶堿對紅曲霉MX1孢子生成的影響Tab.1 Effects of aminophylline and blue light on spore production of Monascus MX1

從表1可以看出，藍光照射培養(yǎng)可以導(dǎo)致紅曲霉MX1分生孢子及子囊孢子數(shù)量增加.其中分生孢子數(shù)提高到空白組(黑暗培養(yǎng)，不添加氨茶堿)的1.43倍，子囊孢子數(shù)提高到空白組的3.36倍.向接種MX1的YES液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的氨茶堿，同樣可以提高分生孢子數(shù)和子囊孢子數(shù)的數(shù)量，其中添加10 mmol/L氨茶堿分生孢子數(shù)最大，是空白組的3.97倍，是藍光培養(yǎng)條件下的2.78倍.向接種MX1的YES培養(yǎng)基中添加氨茶堿至終濃度為15 mmol/L時所生產(chǎn)子囊孢子數(shù)最大，是空白組的3.84倍，是藍光培養(yǎng)條件下的1.14倍.由此可見，藍光和氨茶堿都可以提高紅曲霉分生孢子數(shù)及子囊孢子數(shù).隨著培養(yǎng)基中氨茶堿濃度的增加，MX1孢子數(shù)在達到最高值后明顯減少，這表明過高的氨茶堿濃度能夠抑制紅曲霉產(chǎn)孢.

2.3 藍光及氨茶堿對紅曲霉產(chǎn)桔霉素的影響

在接種紅曲霉MX1的YES液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氨茶堿至終濃度為10 mmol/L，培養(yǎng)8 d，對樣品進行桔霉素含量分析，將結(jié)果與空白組及藍光培養(yǎng)條件下桔霉素含量進行對比，結(jié)果如圖2.

圖2 氨茶堿和藍光誘導(dǎo)培養(yǎng)對紅曲霉MX1發(fā)酵生產(chǎn)桔霉素的影響Fig.2 Effects of aminophylline and blue light on citrinin production by fementation of Monascus MX1

由圖2可以看出，藍光照射培養(yǎng)和添加氨茶堿都可以提高紅曲霉MX1桔霉素的產(chǎn)量，其中空白組和添加氨茶堿組桔霉素產(chǎn)量均在培養(yǎng)5 d達到最高，空白組桔霉素的最高產(chǎn)量為439 μg/mL，氨茶堿添加組桔霉素的最高產(chǎn)量為1 274 μg/mL.藍光培養(yǎng)條件下，桔霉素產(chǎn)量在6 d達到了最高，為729 μg/mL.向培養(yǎng)基中添加10 mmol/L氨茶堿和藍光培養(yǎng)都可以提高桔霉素的產(chǎn)量，分別為空白組的2.90倍和1.66倍.

藍光信號對真菌的影響機理很復(fù)雜，即使在模式菌株——粗糙脈孢菌中也沒有解釋清楚.藍光作為環(huán)境信號作用于真菌，能夠促進真菌體內(nèi)cAMP的生成.在木霉的光照機理研究中發(fā)現(xiàn)，cAMP可以通過激活木霉細胞內(nèi)蛋白激酶的活性進而調(diào)節(jié)木霉的光照反應(yīng)，包括產(chǎn)孢等影響[16-17].在光誘導(dǎo)培養(yǎng)的脈孢菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加能夠減少細胞內(nèi)cAMP含量的阿托品，則可以抑制脈孢菌的光誘導(dǎo)產(chǎn)孢效應(yīng)[18].

通過藍光誘導(dǎo)培養(yǎng)與在培養(yǎng)基中添加能夠促使細胞內(nèi)生成cAMP的氨茶堿，發(fā)現(xiàn)這兩種方式對紅曲霉MX1代謝產(chǎn)生桔霉素及產(chǎn)孢數(shù)量具有相似的影響，說明與木霉一樣，藍光對紅曲霉的產(chǎn)孢及桔霉素代謝調(diào)控可能是通過cAMP途徑進行的.

在對紅曲霉MX1代謝產(chǎn)生桔霉素的研究中發(fā)現(xiàn)，黑暗培養(yǎng)條件下以及向培養(yǎng)基中添加氨茶堿至終濃度為10 mmol/L，紅曲霉MX1代謝產(chǎn)生桔霉素的最高值均出現(xiàn)在培養(yǎng)5d，而藍光誘導(dǎo)培養(yǎng)紅曲霉MX1代謝產(chǎn)生桔霉素的最高值則出現(xiàn)在培養(yǎng)6 d.這說明，藍光除能提高紅曲霉MX1代謝桔霉素的產(chǎn)量，還能改變桔霉素合成的節(jié)律.這可能是由于在光受體蛋白中結(jié)合了一個節(jié)律啟動子，藍光能夠通過這個節(jié)律啟動子來調(diào)節(jié)光可誘導(dǎo)基因的表達節(jié)律[5].而cAMP途徑則不能調(diào)節(jié)光誘導(dǎo)基因的表達節(jié)律.

3 結(jié) 論

在接種紅曲霉MX1的YES液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量能夠促進紅曲霉細胞內(nèi)cAMP生成的氨茶堿，可提高紅曲霉MX1代謝桔霉素的產(chǎn)量及分生孢子和子囊孢子的數(shù)量，這與藍光誘導(dǎo)紅曲霉MX1代謝產(chǎn)生桔霉素和孢子數(shù)量變化一致.藍光可以通過或者部分通過cAMP途徑調(diào)節(jié)紅曲霉MX1桔霉素代謝以及孢子生產(chǎn).這與木霉中藍光信號調(diào)控途徑研究結(jié)論一致[17].但cAMP并沒有改變桔霉素代謝節(jié)律，可見，cAMP途徑并不是藍光誘導(dǎo)紅曲霉代謝的唯一途徑.

雖然藍光照射對真菌毒素——桔霉素的生成有促進作用，但藍光作為調(diào)控真菌代謝的重要方法，其對紅曲霉桔霉素的代謝調(diào)控研究仍具有重要意義.目前，對紅曲霉光照影響機理的研究還處于初步階段，對紅曲霉光照機理進行深入研究是全面研究紅曲霉桔霉素代謝調(diào)控的有效手段之一，通過對桔霉素調(diào)控途徑研究，能更好的為生產(chǎn)中對紅曲霉次生代謝調(diào)節(jié)提供理論支持，從而減少桔霉素的生成.

[1] He Qiyang， Cheng Ping， Yang Yuhong， et al.White collar-1，a DNA binding transcription factor and a light sensor[J].Science， 2002， 297(5582):840843.

[2] Dragovic Z， Tan Ying， G?rl M， et al.Light reception and circadian behavior in‘blind'and‘clock-less'mutants of Neurospora crassa[J].Embo Journal， 2002， 21(14):3643 -3651.

[3] Kumar M S，Kumar P M，Sarnaik H M，et al.A rapid technique for screening of lovastatin-producing strains of Aspergillus terreus by agar plug and neurospora crassa bioassay[J].Journal of Microbiological Methods， 2000， 40(1):99104.

[4] H?ggblom P， Unestam T.Blue light inhibits mycotoxin production and increases total lipids and pigmentation in alternaria alternate[J].Applied and Environment Microbiology， 1979， 38(6):1074 1077.

[5] Froehlich A C， Liu Yi， Loros J J， et al.White collar-1，a circadian blue light photoreceptor，binding to the frequency promoter[J].Science，2002， 297(5582):815-819.

[6] Rodríguez R J， Corrochano L M.The gene for the heatshock protein HSP100 is induced by blue light and heatshock in the fungus phycomyces blakesleeanus[J].Current Genetics， 2004， 46(5):295303.

[7] 朱俊晨，王小菁.藍光促進黑曲霉分生孢子發(fā)育和產(chǎn)糖化酶的研究[J].微生物學(xué)報，2005，45(2):275-278.

[8] Miroslav G， Kolarova N， Farkas? V.Membrane potential， ATP， and cyclic AMP changes induced by light in trichoderma viride[J].Experimental Mycology， 1988，12(4):295301.

[9] Gresík M， Kolarova N， Farkas V.Light-stimulated phosphorylation of proteins in cell-free extracts from trichoderma viride[J].FEBS Letters， 1989， 248(12):185-187.

[10] Kolarova N， Haplová J， Gresík M.Light-activated adenyl cyclase from trichoderma viride[J].FEMS Microbiology Letters， 1992， 72(3):275278.

[11] Calvo A M，Wilson R A，Bok J W，et al.Relationship between secondary metabolism and fungal development[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews:MMBR，2002，66(3):447459.

[12] Pall M L.Adenosine 3′，5′-phosphate in fungi[J].Microbiological Reviews， 1981， 45(3):462480.

[13] 張維成，閻斌，吳振紅.一種釀造粟米黃酒的新工藝[J].北京輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，1998，16(4):6974.

[14] Miyake T， Mori A， Kii T， et al.Light effects on cell development and secondary metabolism inMonascus[J].Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology， 2005， 32(3):103 -108.

[15] Babitha S，Carvahlo J C，Soccol C R，et al.Effect of light on growth，pigment production and culture morphology ofMonascuspurpureus in solid-state fermentation[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24(11):26712675.

[16] Casas-Flores S，Rios-Momberg M，Rosales-Saavedra T，et al.Cross talk between a fungal blue-light perception system and the cyclic AMP signaling pathway[J].Eukaryotic Cell， 2006， 5(3):499 -506.

[17] Nemcovic M，F(xiàn)arkas V.Stimulation of conidiation by derivatives of cAMP in Trichoderma viride[J].Folia Microbiol， 1998， 43(4):399402.

[18] Scott W A， Solomon B.Adenosine 3′，5′-cyclic monophosphate and morphology in neurospora crassa:druginduced alterations[J].Journal of Bacteriology， 1975，122(2):454 -463.