天然活性成分生物轉(zhuǎn)化的微生物、特異酶及其應(yīng)用

金鳳燮, 魚紅閃, 孫長凱, 蘆明春, 劉春瑩, 張春枝, 徐龍權(quán)

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034;2.大連醫(yī)科大學(xué)腦疾病研究所,遼寧大連 116044)

我國中草藥植物有萬余種，但其中少部分只用于藥，大部分用于公眾營養(yǎng)和保健食品，用于化妝品以及日用化學(xué)制品——牙膏甚至色素和墨水等.這些植物的天然活性成分種類繁多，超過6萬余種，可歸納為幾大類:配糖體類(包括三萜皂苷和甾醇皂苷)、黃酮類、醌類、苯丙素類、生物堿類、鞣質(zhì)、酯類等[1].但是這些植物主要的天然成分與化學(xué)藥不同，化學(xué)藥口服后直接吸收，起藥效;而大部分主要的天然成分人體難吸收、活性低，口服后在消化系統(tǒng)內(nèi)轉(zhuǎn)化為另一種高活性結(jié)構(gòu)，吸收起功效;而且人體內(nèi)這種轉(zhuǎn)化很弱，大部分很難利用[2-3].因此，在體外改變低活性、難吸收的天然成分，制備高活性、易吸收的有效成分，對公眾營養(yǎng)食品、功能食品和化妝品、日化產(chǎn)品以及中草藥行業(yè)技術(shù)升級意義巨大.

改變植物天然活性成分結(jié)構(gòu)，生物轉(zhuǎn)化是很有效的方法.然而，其種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)有的微生物和酶解決不了中草藥天然成分的生物轉(zhuǎn)化，必須開發(fā)許多新微生物和新酶類，才能解決天然成分轉(zhuǎn)化制備易吸收、高活性成分的問題.

為此，為了得到易吸收、高活性的天然有效成分，本文篩選一批新微生物，發(fā)現(xiàn)一批新型特異的天然成分轉(zhuǎn)化酶，研究了其特性和應(yīng)用開發(fā).

1 天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化的新微生物篩選和分類鑒定

為了得到易吸收、高活性的天然有效成分，從土壤、人參地、森林地，篩選一批新微生物，確認(rèn)新篩選菌的產(chǎn)酶和天然成分的轉(zhuǎn)化功能，其中有用的菌進(jìn)行分類鑒定，確定其新微生物的屬名和種名.

1.1 新微生物篩選

土壤中的大部分微生物處于休眠狀態(tài)、或者目的微生物數(shù)量很低，因此本文采用兩種方法篩選微生物:富集培養(yǎng)4～5代后分離單菌落;另一種方法是，將土壤樣品稀釋、涂鋪在低營養(yǎng)的培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上、長時(shí)間培養(yǎng)(培養(yǎng)1～3個月)方法，得到單菌落.為了保險(xiǎn)起見，所得到的單菌落在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基重新分離單菌落，測定其16S rRNA基因序列，與在 NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因庫(GenBank)上所登錄的已知菌比較;共篩選了與已知菌的16S rRNA基因序列同源性90%以下的菌有25種，90% ～95%的有43種，95%～97%的50種，97% ～98%的50種的新篩選菌.

一般地來說，16S rRNA基因序列同源性(相似度)為95%以下的菌，直接能確定為新屬(new genus)微生物，同源性在95% ～97%的菌，直接能確定為新種(new species)，同源性97% ～99%的菌，借助分子雜交判斷是否新菌，堿基序列與已知菌基本不配對的為新菌.

因此，篩選了16S rRNA基因與已知菌相差較大的百余種菌，為篩選天然成分轉(zhuǎn)化酶，提供新微生物資源.

1.2 新篩選菌生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)酶功能的確認(rèn)

上述新篩選微生物，隨培養(yǎng)基不同、誘導(dǎo)物不同，所產(chǎn)的天然成分轉(zhuǎn)化酶的種類也不同.上述新篩選的菌種中，選擇16S rRNA基因同源性在Gen-Bank庫中所登錄的已知菌相差較大的，如下20種菌株，研究了產(chǎn)中草藥組分水解酶的功能.

如20種菌株分別在1%的Trypton/L，0.5%的酵母膏，1%的NaCl和0.02%人參提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，與人參皂苷Rb1反應(yīng).其結(jié)果如TLC圖1.

巷道礦壓顯現(xiàn)特征為空間尺度上頂板離層變化大、變化快且各層位離層均較大，表面煤巖快速碎脹并向深部擴(kuò)展。時(shí)間尺度為在開挖的過程及開挖后段時(shí)間內(nèi)變形最快，變形劇烈階段為開挖開始至距離掘進(jìn)工作面30～50 m；后期出現(xiàn)持續(xù)的蠕變和不連續(xù)變形，表現(xiàn)為整體位移持續(xù)增大、頂板離層繼續(xù)增加、表面碎脹逐漸發(fā)展等。

圖1 20種菌株發(fā)酵液對人參皂苷Rb1的水解Fig.1 Twenty kinds of strains on hydrolysis of ginsenoside Rb1

從圖 1 中可以看到:1，3，9，10，14，18 號菌，明顯水解人參皂苷 Rb1;而且15，16，17，20號菌也水解人參皂苷Rb1，說明這些菌，都產(chǎn)人參皂苷酶.

相同的方法，改變菌和培養(yǎng)基、產(chǎn)酶誘導(dǎo)物的方法，可以確認(rèn)其他新菌的天然成分轉(zhuǎn)化功能的產(chǎn)酶菌.其中選擇有特色、有用的菌，進(jìn)行分類鑒定，確定新菌.

1.3 有用菌的分類鑒定

上述新篩選菌中，選擇高產(chǎn)中草藥成分酶的有用菌，按照國際上規(guī)定的新菌分類鑒定方法，確定其微生物屬和種;發(fā)表在國際微生物協(xié)會新菌刊物Int.J.Syst.Evol.Microb(IJSEM)等國際微生物學(xué)刊物上，填補(bǔ)國際微生物學(xué)的新微生物.

例如，作者課題組與韓國KAIST的林完澤博士，共同研究了從人參土壤中分離篩選的新細(xì)菌Gsoil 085T進(jìn)行分類鑒定.該菌的種系分析中提取DNA，其16S rRNA基因用PCR方法擴(kuò)充、分離提純其16S rRNA基因，其16S rRNA基因序列用SeqMan software(DNASTAR)測定的;結(jié)果是1463個堿基對組成;與基因庫(GenBank):利用 BLAST在 NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上登錄的菌上登錄的已知菌比較，該菌屬于細(xì)菌門(phylum Bacteroidetes)的 ‘Flexibacteraceae'科;相近的Emticicia oligotrophicaGPTSA100-15菌比較，16S rRNA的同源性只有94.6%;與‘Flexibacteraceae'科的其他菌相比較，16S rRNA的同源性為83.0%以下;DNA分子雜交結(jié)果，在16S rRNA基因水平上3.0%的基因序列不相同;在全基因水平上涉及70%序列不相同.該菌16S rRNA基因序列，在基因庫中查找新菌種所對應(yīng)的系統(tǒng)生物學(xué)位置，制作“鄰近菌的種系發(fā)生樹“Neighbour-joining phylogenetic tree”，在上述基礎(chǔ)上研究了該菌的分類學(xué)形態(tài)和生化特性.

該菌DNA的G+C含量為40.5%，革蘭氏陰性(Gram negative)，絕對好氧(strictly aerobic)，不運(yùn)動，不利用很多糖;細(xì)胞脂肪酸組成不同于相近的Emticicia oligotrophicaGPTSA100-15菌是新的Emticicia屬中一個新種，命名為Emticicia ginsengisolisp.nov..新發(fā)現(xiàn)的菌確定其屬名和種名，刊登在國際微生物協(xié)會新菌刊物Int J Syst Evol Microb等國際微生物學(xué)刊物上，增添國際微生物學(xué)的新菌.

本課題組分類鑒定的新菌為:Emticicia ginsengisolisp.nov.菌(Int J Syst Evol Microb，2008，58，1100-1105);Kaistia granulisp.Nov.菌(Int J Syst Evol Microb， 2007， 57:2280-2283);Hymenobacter daecheongensissp.nov. 菌(Int J Syst Evol Microb，2009， 59，331 -335);Spirosoma panaciterraesp.nov.菌(Int J Syst Evol Microb，2009，59，1183-1187);Terrabacter ginsenosidimutanssp.nov.菌(Appl Enviro Microb， 2010， 76，5827-5836);Phycicoccus ginsenosidimutanssp.nov.菌(Int J Syst Evol Microb， 2011， 61，524-528);Mucilaginibacter compostisp.nov. 菌(J Microb，2011，49，393398);Ramlibacter ginsenosidimutanssp.nov.菌(J Microbiol Biotechnol， 2012， 22:311-315)等;不僅增添國際微生物新菌，為篩選天然成分轉(zhuǎn)化酶，提供一批新微生物資源.

2 特異的天然成分轉(zhuǎn)化酶及其特性

圖2 人參皂苷糖苷酶I型催化反應(yīng)Fig.2 Catalytic reaction of ginsenoside glucosidase I type

上述新微生物和重要的已知菌發(fā)酵，用離子交換柱、凝膠柱、分子篩等的分離方法，分離純化得到純的酶蛋白，其純酶與各種天然活性成分的單體分別反應(yīng)，確定酶的催化反應(yīng)，研究該酶的其他特性，然后與國際上已公布的酶相比較，確定是否為新酶.由此，發(fā)現(xiàn)了一批新的特異性天然活性成分轉(zhuǎn)化酶.

2.1 特異的人參、薯蕷、白頭翁等皂苷酶

用上述方法，發(fā)現(xiàn)了一批皂苷酶;其中4種人參皂苷酶 I、II、III、IV 型，其酶分別如下.

人參皂苷糖苷酶I型[4]，能水解人參二醇類皂苷 Rb1、Rb2、Rb3、Rc的(第 3 碳)3-O-的 β-(1→6)-葡萄糖苷鍵;水解(第20碳)20-O-位置的 β-(1→6)-葡萄糖苷鍵、α-(1→6)-阿拉伯糖苷鍵、β-(1→6)-木糖苷鍵和 3-碳(3-O-)上的 β-(1→2)-葡萄糖苷鍵等多種糖基，生成F2;F2進(jìn)一步水解成C-K以及皂苷元(PPD)，其催化反應(yīng)如圖2.

人參皂苷糖苷酶II型[5]，能水解人參二醇類皂苷 Rb1、Rb2、Rb3、Rc 的 20-O-位置的 β-(1→6)-葡萄糖苷鍵、α-(1→6)-阿拉伯糖苷鍵、β-(1→6)-木糖苷鍵等多種糖基，生成Rd和Rg3皂苷.

人參皂苷糖苷酶III型[6]，能水解人參二醇類皂苷的3-O-位置的糖基.來源于霉菌的酶水解Rd的3-O-糖苷，生成C-K;基因重組酶III型(新發(fā)現(xiàn)菌T ginsenosidimutanssp.nov.的bgpA基因，克隆到E-.coli細(xì)胞中表達(dá)的得到的酶，736個氨基酸殘基，分子量81 kDa)，水解3-O-位置的糖基:水解Rb1皂苷3-O-位置的糖基、逐步生成 Gyp17→Gyp75;同樣，Rb2變成C-O→C-Y;Rc變成C-McI→C-Mc;水解Rd的3-O-糖基、逐步變成F2→C-K皂苷，如圖3.

圖3 人參皂苷糖苷酶III型催化反應(yīng)Fig.3 Catalytic reaction of ginsenoside glucosidase III type

人參皂苷酶IV型[7-8]，能水解人參三醇類皂苷Re、R1、Rf、Rg2 皂苷的 6-O-位置上的多種糖基，如圖4.

歸納人參皂苷酶特性，人參皂苷I型酶水解人參皂苷第3碳、第20碳上的糖基;人參皂苷II型酶水解人參皂苷第20碳上的多種糖基;人參皂苷III型酶水解人參皂苷第3碳上的糖基;人參皂苷IV型酶水解人參皂苷第6碳上的多種糖基，是新酶.

用上述方法，也發(fā)現(xiàn)一些其他皂苷酶:薯蕷(穿山龍)甾醇皂苷酶[9]，能水解薯蕷皂苷3-碳(3-O-)上的α-(1→2)-鼠李糖苷鍵、α-(1→4)-鼠李糖苷鍵和β-葡萄糖苷鍵，其催化反應(yīng)如圖5所示.

柴胡皂苷酶[10]，能水解柴胡皂苷的3-O-上的多種糖基;白頭翁皂苷酶，能水解白頭翁皂苷的3-O-和28-O-上多種糖基;還有黃芪、朱砂根和大豆皂苷酶等.

圖4 人參皂苷糖苷酶IV型催化反應(yīng)Fig.4 Catalytic reaction of ginsenoside glucosidase IV type

圖5 薯蕷(穿山龍)甾醇皂苷酶催化反應(yīng)Fig.5 Enzyme-catalyzed reactions of Yam(dioscorea)sterol saponins

上述皂苷酶的催化反應(yīng)共性為，對苷元種類和糖基位置選擇性高，對糖基種類(葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等種類)選擇性低，能水解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等多種糖基;這與國際酶學(xué)上的160余種糖苷酶“一種酶水解一種糖基(糖苷鍵)”(NC-IUBMB in http:∥www.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme)的普遍規(guī)律所不同，是一類特異性的新苷酶，增添了國際酶學(xué)的一批新的皂苷酶[11].

2.2 其他天然活性成分轉(zhuǎn)化酶

用上述方法發(fā)現(xiàn)一些其他天然成分轉(zhuǎn)化酶:水解蘆丁轉(zhuǎn)化為異槲皮素和槲皮素的蘆丁苷酶[12]，黃芩苷轉(zhuǎn)化為抗艾滋病毒的黃芩苷酶，大豆異黃酮的苷酶，紅景天苷酶水解和合成酶[13]，丹酚酸B轉(zhuǎn)化為丹參素和低聚丹酚酸的丹酚酸酶，制備高活性淫羊藿苷的淫羊藿苷酶;其中大豆異黃酮的苷酶的催化反應(yīng)如圖6.

圖6 大豆異黃酮苷酶催化反應(yīng)Fig.6 Catalytic reaction of soy isoflavones glycosidase

以上篩選了一批新的特異的天然成分轉(zhuǎn)化酶，為活性低、難吸收的天然成分轉(zhuǎn)化為高活性的有效成分，提供了一批新酶.

3 特異的天然成分轉(zhuǎn)化酶應(yīng)用

為了上述新的天然成分轉(zhuǎn)化酶的應(yīng)用，育種了一些天然成分轉(zhuǎn)化酶的生產(chǎn)菌;發(fā)現(xiàn)其酶在普通酶(淀粉、蛋白酶)發(fā)酵條件下不產(chǎn)，只有在發(fā)酵環(huán)境和營養(yǎng)惡劣條件下才產(chǎn)酶;建立了貧營養(yǎng)極端發(fā)酵法、生產(chǎn)天然成分轉(zhuǎn)化酶類的方法.建立了從植物中提取天然成分轉(zhuǎn)化酶方法.發(fā)現(xiàn)上述新酶抗有機(jī)溶劑;建立了酶生產(chǎn)中，用無毒有機(jī)溶劑沉淀酶方法，分離酶和產(chǎn)物;建立酶不用固定化、重復(fù)使用方法.在此基礎(chǔ)上，利用天然成分轉(zhuǎn)化酶生產(chǎn)了高活性天然活性成分;生產(chǎn)了高活性單體成分、高活性組分、高活性成分含量高的中草藥和提取物;研究開發(fā)了高活性成分的公眾營養(yǎng)食品、功能食品和化妝品.

1)酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)高活性單體成分:如酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)高活性單體皂苷C-K和F1的制備.人參皂苷C-K(Compound-K)在天然的人參中并不存在，是原人參二醇類皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rd 等)在人腸道內(nèi)代謝的末端產(chǎn)物，是人體吸收的結(jié)構(gòu)，具有抗突變、抗過敏、抗搔癢、抗敗血病、抗糖尿病、抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，對保健食品、化妝品、人參藥物意義很大，但是尚無產(chǎn)業(yè)化大量生產(chǎn).同樣，F(xiàn)1皂苷在天然的人參中并不存在，是原人參三醇類皂苷(Re、R1、Rg1等)在人腸道內(nèi)代謝的產(chǎn)物，人體易吸收、具有保肝、益智等藥理和保健功能，其結(jié)構(gòu)如圖7.

圖7 人參皂苷C-K和F1的結(jié)構(gòu)Fig.7 Structure of ginsenoside C-K and F1

利用新發(fā)現(xiàn)的人參皂苷酶I型[4]和IV型[5]，分別轉(zhuǎn)化生產(chǎn)高活性C-K和F1皂苷;其轉(zhuǎn)化率為70% ～90%;酶不用固定化，反應(yīng)后，重復(fù)使用，酶的回收率為70%～80%.

2)生物轉(zhuǎn)化法制備4種異構(gòu)體的Rg2組、Rg3組、Rh1組等紅參稀有皂苷群:如，Rg2組等由20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、Rg6 和 Rg4(F4)等 4 種異構(gòu)體皂苷組成，Rg2組皂苷的結(jié)構(gòu)與組成，如圖8.

圖8 Rg2組產(chǎn)品皂苷結(jié)構(gòu)與組成的HPLCFig.8 Rg2 group saponins structure and HPLC of composition

紅參稀有皂苷Rg2組，Rg3組，Rh1組等，由于四種異構(gòu)體皂苷協(xié)同作用而比單體皂苷活性高，水中的溶解度高，更適合于開發(fā)人參制品、公眾營養(yǎng)食品、化妝品和人參藥物.如紅參稀有皂苷Rg3組，20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1和Rg5等4種異構(gòu)體協(xié)同作用，比Rg3皂苷單體，抗癌、抗血栓、調(diào)節(jié)胰島素活性提高較大.

本課題組與企業(yè)聯(lián)合，利用生物轉(zhuǎn)化法分別生產(chǎn)，4種異構(gòu)體含量90%以上的Rg3組，Rg2組，Rh1組等;開發(fā)其應(yīng)用，用于公眾營養(yǎng)食品、人參制品、化妝品等添加劑.生物酶轉(zhuǎn)化法，也生產(chǎn)了高活性白頭翁皂苷組、高活性大豆異黃酮等，正開發(fā)其制品.

3)利用中草藥植物本身含有的自身酶作用，在中藥加工過程中發(fā)揮自身酶的作用，制備高活性有效成分含量高的中藥或者提取物——活性中藥.也就是說，中藥加工過程中，有目的地發(fā)揮自身酶作用，提高活性有效成分的含量，改變了傳統(tǒng)的中藥加工的炮制和煎制等、傳統(tǒng)的盲目性的加工方法.

如人參植物中含有人參自身皂苷酶[14-15]，在傳統(tǒng)紅參加工過程中激活人參自身皂苷酶，制備活性紅參;其活性紅參中的稀有皂苷 Rg3，Rg5，Rh2，Rh3，Rg2，Rg4，Rh1，Rh4 含量比傳統(tǒng)紅參提高十幾倍，同時(shí)人參中部分人上火成分Re，Rg1含量，降低到西洋參水平.

同樣，也制備了高活性成分含量高的黃芩、丹參等提取物，提取了高活性大豆異黃酮混合物.開發(fā)了其公眾營養(yǎng)食品、功能化妝品.

總之，為了得到易吸收、高活性的天然有效成分，本文篩選了一批新微生物，發(fā)現(xiàn)了一批新型特異的天然成分轉(zhuǎn)化酶，開發(fā)了一批高活性的有效天然成分、高活性異構(gòu)體混合物和活性中藥，也開發(fā)了一些制品，也正在拓寬研發(fā)范圍.

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