白藜蘆醇對白血病K562細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制探討

隋 濤 ，白 雪，馬 立，李 青

(天津市第一中心醫(yī)院，天津300192)

白藜蘆醇是一種具有多種生物活性的天然植物成分，自然界許多植物中有白藜蘆醇及其苷類。白藜蘆醇是植物在遇到真菌感染、紫外線照射時(shí)所產(chǎn)生的植物補(bǔ)體，對植物起保護(hù)作用。近年研究［1，2］發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇在人體內(nèi)具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制血小板聚集、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性和藥理作用，具有很大的藥用價(jià)值。然而，對于白藜蘆醇的抗腫瘤效果爭議則很大，低濃度或高濃度的白藜蘆醇對不同的腫瘤有抑制或促進(jìn)作用［3～5］。為了解白藜蘆醇在抗白血病中的作用，我們觀察了白藜蘆醇對人白血病細(xì)胞K562生長的影響，并對其相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行了探討?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1．1 主要試劑 白藜蘆醇購自Sigma公司，胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司，CKK-8試劑盒購自同仁化學(xué)研究所，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。白藜蘆醇用DMSO溶解，實(shí)驗(yàn)時(shí)用RPMI1640稀釋成不同濃度。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 將K562細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的 RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1．3 白藜蘆醇對K562細(xì)胞增殖影響的觀察 采用CCK-8法。將處于對數(shù)生長期的K562細(xì)胞以1×104/每孔接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為5、10、15、30、60 μmol/L 的白藜蘆醇，對照組加入等量的DMSO，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置37℃、5%CO2濕潤培養(yǎng)箱中分別孵育 24、48、72、96 h，每孔加入20μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后吸去上清液，加入DMSO 150μL，用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值(A值)。按照公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率:細(xì)胞生長抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．4 白藜蘆醇對K562細(xì)胞凋亡影響的觀察 采用AnnexinV-FITC/PI雙染法。將對數(shù)生長期的K562細(xì)胞以3×106/每孔接種于24孔板，分別加入終濃度為 5、10、15、30、60 μmol/L 的白藜蘆醇培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌3次，加入5μL的AnnexinV-FITC和1μL的PI混均，避光孵育10 min，PBS洗滌1次，每管加入400μL的PBS，采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1．5 白藜蘆醇對K562細(xì)胞周期影響的觀察 采用流式細(xì)胞儀檢測K562細(xì)胞周期。將對數(shù)生長期的K562細(xì)胞以3×106/每孔接種于24孔板，分別加入終濃度為 5、10、15、30、60 μmol/L 的白藜蘆醇培養(yǎng)48 h后PBS洗滌3次，加入70%冷乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜后離心棄上清，PBS重懸細(xì)胞后加入PI染液，4°C避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，流式細(xì)胞儀自帶軟件分析細(xì)胞周期的分布。

1．6 K562細(xì)胞中與細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)的蛋白檢測 采用Western blot法。將對數(shù)生長期的K562細(xì)胞以4×106/每瓶接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，用終濃度為60μmol/L的白藜蘆醇處理48 h后按常規(guī)方法裂解K562細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量，取30μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后將SDS-PAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗(Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Cyclin D1)4℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h后ECL顯影，測各蛋白灰度值。以β-actin作為內(nèi)參照。對照組細(xì)胞以DMSO代替白藜蘆醇進(jìn)行培養(yǎng)，操作同上。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料組間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 白藜蘆醇對K562細(xì)胞增殖的影響 隨著白藜蘆醇濃度逐漸增加和作用時(shí)間的延長，K562細(xì)胞的生長抑制率上升(P均＜0．05)，見表1。

表1 白藜蘆醇對K562細(xì)胞增殖的影響(%)

2．2 白藜蘆醇對K562細(xì)胞凋亡的影響 K562細(xì)胞經(jīng)不同濃度白藜蘆醇作用48 h后，細(xì)胞凋亡顯著增加，且以早期凋亡為主，K562細(xì)胞的凋亡率隨白藜蘆醇濃度的增高而上升(P＜0．05)，且晚期凋亡的K562細(xì)胞也逐漸增加，見表2。

表2 白藜蘆醇對K562細(xì)胞凋亡的影響(%，ˉx±s)

2．3 白藜蘆醇對K562細(xì)胞周期的影響 經(jīng)白藜蘆醇作用48 h后，K562細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化，隨著白藜蘆醇濃度的增加，G1期細(xì)胞逐漸增多(P＜0．05)，而 S期細(xì)胞逐漸減少(P ＜0．05)，表明白藜蘆醇可阻止K562細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制K562細(xì)胞的增殖，見表3。

表3 白藜蘆醇對K562細(xì)胞周期的影響(%，ˉx±s)

2．4 白藜蘆醇對K562細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞經(jīng)60μmol/L的白藜蘆醇作用48 h后，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)減少(Bcl-2和Bcl-xl灰度與β-actin灰度比值分別為0．54±0．09 和0．36 ±0．11)，而促凋亡蛋白 Bax表達(dá)增多(Bax灰度與β-actin灰度比值為1．46±0．28)。實(shí)驗(yàn)組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)與對照組(Bcl-2、Bcl-xl、Bax灰度與 β-actin 灰度比值分別為 1．03 ±0．23、1．12 ±0．24、0．75 ±0．15)相比，P 均 ＜0．05。

2．5 白藜蘆醇對 K562細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞經(jīng)60 μmol/L的白藜蘆醇作用48 h后，Cyclin D1表達(dá)顯著降低(Cyclin D1灰度與β-actin灰度比值為0．43±0．13)，與對照組(Cyclin D1灰度與 β-actin灰度比值為1．16 ±0．27)相比，P ＜0．05。

3 討論

近年研究［6～11］發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，如卵巢癌細(xì)胞、胃腸腫瘤細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞及膠質(zhì)瘤細(xì)胞等。因此，白藜蘆醇在腫瘤治療方面的價(jià)值逐漸引起人們的關(guān)注［12］。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇以時(shí)間和劑量依賴的方式抑制白血病K562細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種主動(dòng)性死亡過程，是受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶和特定信號通路調(diào)控的一個(gè)級聯(lián)激活過程，相關(guān)基因包括促凋亡基因和凋亡抑制基因。Bcl-2家族是最重要的凋亡調(diào)節(jié)因子之一，Bcl-xl與Bcl-2具有相似的抑制細(xì)胞凋亡的功能，而Bax則是凋亡促進(jìn)因子，它們通過調(diào)節(jié)線粒體的功能來調(diào)控細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激后是否凋亡取決于Bcl-2/Bax、Bcl-xl/Bax 平衡。文獻(xiàn)［13］報(bào)道，白藜蘆醇通過改變Bcl-2蛋白家族的表達(dá)降低多種腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位，增加細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而活化Caspases。本研究結(jié)果顯示，白血病K562細(xì)胞經(jīng)白藜蘆醇作用后其Bcl-2與Bcl-xl的表達(dá)水平降低，而Bax的表達(dá)水平升高。提示白藜蘆醇在不同類型的腫瘤細(xì)胞通過共同的信號途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括K562細(xì)胞。

Cyclin D1是重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，在G0～G1期細(xì)胞中表達(dá)，通過與細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶CDK4和CDK6結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞發(fā)生增殖與分裂［14］。Cyclin D1表達(dá)上調(diào)是誘導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控異常導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的主要原因之一。研究［15］證實(shí)，多種腫瘤細(xì)胞中Cyclin D1過度表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇作用后K562細(xì)胞中處于G1期的細(xì)胞增多，而處于S期的細(xì)胞減少，同時(shí)其Cyclin D1表達(dá)下降。提示白藜蘆醇通過下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，延遲K562細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，發(fā)揮其抑制白血病K562細(xì)胞增殖的作用。

總之，白藜蘆醇在體外可以抑制白血病K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。其抗K562細(xì)胞增殖的效果可能與下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)進(jìn)而延遲細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期有關(guān)，其誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)Bax表達(dá)、下調(diào)Bcl-xl和Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

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