結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

孫海柏，張 立，劉佳慶，杜巖青，曹 宏

(天津市海河醫(yī)院，天津300350)

在肺結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷中，結(jié)核菌培養(yǎng)可以作為確診肺結(jié)核的主要依據(jù)，但是檢測時(shí)間長，容易延誤病情，并且針對不同類型的肺結(jié)核來講結(jié)核菌培養(yǎng)并非全部適用，容易漏診。近年來，一種以T細(xì)胞為基礎(chǔ)的體外γ-干擾素釋放試驗(yàn)及結(jié)核分枝桿菌T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT．TB)得到了較快的發(fā)展，在歐美國家已經(jīng)成為結(jié)核病臨床常規(guī)檢測方法之一［1］。目前臨床上應(yīng)用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括痰涂片結(jié)核桿菌檢測、T-SPOT．TB、結(jié)核菌核酸檢測(TB-DNA)、抗結(jié)核抗體檢測4種，我們對這4種方法在診斷肺結(jié)核中的敏感性及特異性作了對比分析，探討肺結(jié)核快速、準(zhǔn)確的診斷方法。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 2010年4月～2013年4月在天津市海河醫(yī)院接受肺結(jié)核篩查的病例共1 673例。肺結(jié)核組1 171例，男879例，女292例;年齡18～84歲;根據(jù)臨床表現(xiàn)、病史、X線胸片檢查結(jié)果以及結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)果作出診斷;依據(jù)《結(jié)核病診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為原發(fā)性肺結(jié)核96例，血型播散型肺結(jié)核262例，繼發(fā)性肺結(jié)核487例，結(jié)核性胸膜炎326例;跟據(jù)痰涂片結(jié)核桿菌檢測結(jié)果分為痰涂片陰性肺結(jié)核241例，痰涂片陽性肺結(jié)核930例。非肺結(jié)核組502例，男325例，女177例;年齡28～78歲;根據(jù)臨床表現(xiàn)、病史、X線胸片檢查結(jié)果以及結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)果等排除肺結(jié)核，并進(jìn)行2個(gè)月跟蹤隨訪未出現(xiàn)結(jié)核病相關(guān)臨床癥狀。

1．2 痰涂片結(jié)核桿菌檢測、T-SPOT．TB、TB-DNA、抗結(jié)核抗體檢測方法 ①痰涂片結(jié)核桿菌檢測:痰涂片鏡檢采用萋—尼抗酸染色法，第1次鏡檢陰性痰標(biāo)本重復(fù)第2、3次留痰檢查。胸腹水等非痰標(biāo)本離心后取沉渣涂片鏡檢。結(jié)核桿菌呈紅色，其他細(xì)菌及細(xì)胞呈藍(lán)色。②T-SPOT．TB:試劑盒來自英國Oxford Immunotec Limited公司。按照說明書進(jìn)行操作，根據(jù)抗原A和(或)抗原B孔的反應(yīng)判斷結(jié)果:a．對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，樣本斑點(diǎn)數(shù)(抗原A孔或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))－對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)判斷為陽性;b．對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，樣本斑點(diǎn)數(shù)(抗原A孔或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))≥2倍對照孔斑點(diǎn)數(shù)判斷為陽性。③TB-DNA:采用實(shí)時(shí)熒光PCR法。DNA的提取按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。結(jié)果判定:按照試劑盒說明書，如果Ct值=30，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性;如果Ct值＜30，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性。④抗結(jié)核抗體檢測:抗結(jié)核抗體檢測試劑盒購于北京華醫(yī)杏林醫(yī)療技術(shù)有限公司代理的英國OMEGA診斷試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀讀取光密度值(OD值)，在標(biāo)準(zhǔn)滴度曲線表中查找，得出相應(yīng)標(biāo)本中抗結(jié)核抗體滴度，＞400 U/mL為陽性。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件。率的比較用χ2檢驗(yàn)。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 4種檢測方法的檢測結(jié)果 詳見表1。

表1 兩組受檢對象四種檢測方法的檢測結(jié)果(例)

表2 4種檢測方法診斷肺結(jié)核的靈敏性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及約登指數(shù)

2．3 4種檢測方法診斷不同類型肺結(jié)核的陽性率

與其他3種方法相比，T-SPOT．TB診斷各型肺結(jié)核的陽性率最高(P均＜0．05)。詳見表3。

表3 4種檢測方法診斷不同類型肺結(jié)核的陽性率(%)

2．4 T-SPOT．TB、TB-DNA、抗結(jié)核抗體檢測對痰涂片陰性與痰涂片陽肺結(jié)核的診斷結(jié)果 T-SPOT．TB診斷痰涂片陰性與痰涂片陽性肺結(jié)核的陽性率明顯高于其他兩種檢測方法(P均＜0．05)，但T-SPOT．TB診斷痰涂片陰性與痰涂片陽性肺結(jié)核的陽性率相近 (P＞0．05)。詳見表4。

表4 T-SPOT．TB、TB-DNA、抗結(jié)核抗體檢測對痰涂片陰性與痰涂片陽性肺結(jié)核的診斷結(jié)果

2．5 T-SPOT．TB、TB-DNA、抗結(jié)核抗體檢測診斷痰涂片陰性肺結(jié)核的靈敏性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值 T-SPOT．TB診斷痰涂片陰性肺結(jié)核的靈敏性明顯高于其他兩種檢測方法(P均＜0．05)，但特異性不高。詳見表5。

表5 T-SPOT．TB、TB-DNA、抗結(jié)核抗體檢測診斷痰涂片陰性肺結(jié)核的靈敏性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值(%)

3 討論

傳統(tǒng)的痰涂片檢測結(jié)核桿菌陽性率較低，特別在含菌量少的情況下，而且無法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌?？菇Y(jié)核抗體作為快速診斷肺結(jié)核的參考指標(biāo)之一，其敏感性低，特異性不高，檢測結(jié)果容易受到卡介苗接種的影響。本研究中肺結(jié)核患者抗結(jié)核抗體陽性率僅為52%。TB-DNA檢測診斷肺結(jié)核有其獨(dú)特的優(yōu)勢［2］，本研究發(fā)現(xiàn)，其診斷不同類型肺結(jié)核雖有較好的特異性，但靈敏性、陰性預(yù)測值、約登指數(shù)較低。

T-SPOT．TB檢測原理:①在結(jié)核分枝桿菌中存在RD1基因序列，而在卡介苗菌株和絕大部分環(huán)境中的分枝桿菌基因中則缺乏該序列［3］。RD1編碼產(chǎn)生兩種蛋白，即ESAT-6和CFP-10，其作為特異性抗原刺激機(jī)體T淋巴細(xì)胞成為致敏T淋巴細(xì)胞，后者產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ。②T-SPOT．TB是一種酶免疫技術(shù)，從單細(xì)胞水平檢測分泌抗體細(xì)胞或分泌細(xì)胞因子細(xì)胞，每1個(gè)顯色斑點(diǎn)代表1個(gè)結(jié)核分枝桿菌致敏的T淋巴細(xì)胞。根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)可以判斷體內(nèi)是否存在針對結(jié)核分枝桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，并可計(jì)數(shù)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量。此方法能從60 000個(gè)分泌IFN-γ的細(xì)胞中測出1個(gè)細(xì)胞，不受卡介苗接種的影響，交叉反應(yīng)少，特異性很高。本研究發(fā)現(xiàn)，針對不同種類的肺結(jié)核，T-SPOT．TB都有較高的敏感性和特異性。

原發(fā)性肺結(jié)核以兒童發(fā)病為主，兒童吐痰比較困難，所以痰涂片和痰TB-DNA檢測都不能發(fā)揮很好的作用，抗結(jié)核抗體檢測的陽性率僅為24．6%，而T-SPOT．TB檢測的陽性率達(dá)76．45%，且敏感性較高，T-SPOT．TB可以協(xié)助診斷兒童結(jié)核病及對抗結(jié)核藥物治療效果進(jìn)行評估［4，5］。由于效應(yīng)T淋巴細(xì)胞在外周血中的壽命比較短，故該方法還能判斷藥物治療后患者體內(nèi)是否清除了結(jié)核菌［6］。

結(jié)核病內(nèi)源性復(fù)發(fā)是繼發(fā)性肺結(jié)核的主要發(fā)病原因，結(jié)核病外源性再感染是指曾感染過結(jié)核菌，這類人群痰涂片的敏感性是24．01%，抗結(jié)核抗體的陽性率達(dá) 70．8%，TB-DNA 陽性率為 54．1%，而T-SPOT．TB的陽性率達(dá)91．2%。T-SPOT．TB 診斷血行播散性肺結(jié)核的敏感性達(dá)87%，而其他3種檢測方法的陽性率都不是很高。結(jié)核性胸膜炎患者胸水涂片檢測結(jié)核菌陽性率較低，胸水抗結(jié)核抗體檢測陽性率為 39．6%，TB-DNA 陽性率僅為 27．5%，而T-SPOT．TB診斷結(jié)核性胸膜炎的陽性率達(dá)69．94%，較有診斷意義，同時(shí)有相關(guān)文獻(xiàn)［7，8］報(bào)道其還能協(xié)助鑒別結(jié)核性及非結(jié)核性胸膜炎。在4種檢測方法中，T-SPOT．TB診斷痰涂片陰性肺結(jié)核的敏感性最高，但其特異性較低，所以區(qū)分痰涂片陽性肺結(jié)核和痰涂片陰性肺結(jié)核，要同時(shí)結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、病史、X線胸片檢查進(jìn)行診斷。

綜上所述，4種檢測方法中T-SPOT．TB診斷各類肺結(jié)核敏感性最高，能在48 h之內(nèi)出結(jié)果，比傳統(tǒng)的結(jié)核菌培養(yǎng)有很大優(yōu)勢，用于初發(fā)疑似肺結(jié)核的篩查診斷效果優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測手段。

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