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    六種貓科動物線粒體基因組比較

    2013-07-05 01:07:36柳建國諸立新
    滁州學(xué)院學(xué)報(bào) 2013年2期
    關(guān)鍵詞:雪豹密碼子獵豹

    魏 磊,柳建國,劉 芳,諸立新

    線粒體基因組(mitochondrial genome,mtDNA)是核外遺傳物質(zhì),具有分子小、結(jié)構(gòu)緊湊、演化快速、種間差異大、種群內(nèi)穩(wěn)定性高、母系遺傳及無重組等特性[1-3]。近年來,線粒體全基因組序列比較分析作為一種基因進(jìn)化的模式已被廣泛地應(yīng)用于分子動力學(xué)、比較遺傳學(xué)、物種進(jìn)化和系統(tǒng)關(guān)系的研究[4]。

    貓科動物的線粒體是一種雙鏈DNA分子,含有13個(gè)左右的蛋白編碼基因、2個(gè)rRNA和22個(gè)tRNA基因。在線粒體基因組所編碼的37個(gè)基因中,NADH 2、NADH 4、12/16SrRNA、Cyt b和D-loop區(qū)等材料相繼被用于貓科動物的系統(tǒng)學(xué)研究[5-6]。全球現(xiàn)存37種動物貓科動物(Felidae),而線粒體全序列測序的物種較少,因而補(bǔ)充該類群線粒體全序列有利于正確地解決其存在的系統(tǒng)發(fā)育問題。本文測定了豹(Panthera pardus)、虎(Panthera tigris)和雪豹(Panthera uncia)線粒體基因組全序列,并與貓(Felis catus)、獵豹(Acinonyx jubatus)和云豹(Neofelis nebulosa)線粒體基因組全序列進(jìn)行比較分析,為貓科動物線粒體譜系基因組學(xué)的研究提供新的數(shù)據(jù)資料。

    1 材料與方法

    1.1 線粒體DNA提取和擴(kuò)增

    用線粒體萃取試劑盒(GENMED Scientifics Inc.,USA)抽提與萃取線粒體DNA。根據(jù)Gen-Bank已公布的家貓、獵豹和云豹線粒體基因組全序列及虎的部分線粒體基因組序列,利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)出34對引物。PCR反應(yīng)都在PTC-200型DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)總體系為30μL,其中含有10mmol Tris-HCl(pH 8.3),50mmol KCl,1.5mmol MgCl2,100μmol dNTPs,引物各0.25μmol,1UTaq DNA 聚合酶,總DNA約25ng。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性45s,52~60℃復(fù)性50s,72℃延伸50s,共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。循環(huán)前95℃預(yù)變性5min,循環(huán)后繼續(xù)延伸7min。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖電泳檢測。

    1.2 測序及序列分析

    擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收后,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測序。測序得到的序列通過DNASTAR(2001)、Clustal X(1.8)和測序峰圖結(jié)果分析軟件 Chromas 2.22分析,經(jīng)人工校正、BLAST 比對后拼接,最后得到豹、虎和雪豹線粒體控制區(qū)的全部序列,GenBank序列檢索號分別EF551002、EF551003和EF551004。從GenBank獲取貓(NC-001700)、獵 豹 (AY463959)和 云 豹(DQ257669)線粒體全序列[7-9],用 ClustalX 軟件對貓、獵豹、豹、虎、雪豹和云豹線粒體全序列進(jìn)行比對,用 MEGA 3.0統(tǒng)計(jì)線粒體基因組堿基組成,蛋白質(zhì)基因密碼子使用頻率,使用DNAsis模擬tRNA的二級結(jié)構(gòu)。

    2 結(jié)果

    2.1 線粒體基因組組成與排列

    貓、獵豹、豹、虎、雪豹和云豹線粒體全序列全長分別為17009 、17011、16964、16990、16773和16844bp。線粒體基因組與其它脊椎動物相似,由13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)tRNA,2個(gè)rRNA、一個(gè)非編碼的控制區(qū) (D-loop)和一個(gè)輕鏈復(fù)制起點(diǎn)(OLR)所組成。除 NADH6和tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(UCN)、tRNAGlu、tRNAPro在 L-鏈(light strand)上編碼之外,其余基因均在 H-鏈(heavy strand)編碼?;蚺帕芯o密,每個(gè)物種的線粒體基因存在8~10處的基因重疊,其中重疊堿基較多的是ATPase 8和ATPase 6基因,重疊范圍在41~43bp;基因間隔8~11處,大小在1~25bp之間,基因間隔最大的是在雪豹線粒體COIII~tRNAGly之間,間隔長度為25bp。

    2.2 線粒體核苷酸組成

    6種貓科動物線粒體基因組的整個(gè)堿基組成中,堿基含量的大小排列是A>T>C>G。A-T含量比G-C含量高,而且AT偏斜也比GC偏斜高。13種蛋白質(zhì)編碼基因、22種tRNA基因、2種rRNA基因和D-loop區(qū)的詳細(xì)的堿基組成分析被列于表1中。在蛋白質(zhì)編碼基因第一密碼子中,豹和貓 A的含量偏低,分別為22.5%和27.3%,略低于整個(gè)線粒體基因組A的平均含量(31.8%);貓、獵豹、云豹、虎和雪豹的含量遠(yuǎn)高于整個(gè)線粒體基因組G的平均含量;在蛋白質(zhì)編碼基因第二密碼子中,豹T的含量偏低,分別為22.6%,而貓、虎、雪豹、獵豹和云豹T的含量分別為32.0%、40.4%、40.1%、38.7%和41.6%,表現(xiàn)出對T的偏好;特殊的是在第二密碼子中,只有豹G的含量低,為8.1%,其它的則基本一致;第三密碼子在堿基使用上也出現(xiàn)較大的差異,云豹和豹G的含量較高,分別為25.1%和19.2%,高于整個(gè)線粒體基因組G的平均含量,而其它4個(gè)物種G的含量則低于整個(gè)基因組G的含量(表1)。

    表1 6種貓科動物線粒體基因組不同部分的核苷酸組成

    2.3 蛋白質(zhì)編碼基因

    2.3.1 蛋白質(zhì)編碼基因密碼子使用

    在6種貓科動物mtDNA的蛋白質(zhì)編碼基因中,NADH1、NADH4L、ND4、COI、COII、ATP6、ATP8和Cytb的起始密碼子為 ATG,云豹的ND6的起始密碼子也是ATG;雪豹的COIII是以ATA為起始密碼子的。NADH3和NADH5的起始密碼子為ATA;貓、豹、虎和雪豹ND2的起始密碼子為ATC,而云豹和獵豹ND2的起始密碼子為ATT;豹、虎、雪豹、貓和獵豹的Cyt b起始密碼子為ATG,只有云豹Cyt b基因較例外,起始密碼子為ATA。在終止密碼子 的 使 用 上,ND4L、ND5、ND6、COI、COII、ATP6和ATP8都以TAA為終止密碼子;除獵豹的ND1以TA終止,其它五個(gè)物種的ND1也是以TAA為終止密碼子的。六種貓科動物ND2和ND4都以單一密碼子T為終止密碼子,ND3都以TA為終止密碼子;雪豹的COIII基因較為特殊,以TAA終止,其它五個(gè)物種的COIII基因是以T終止的(表2)。6種貓科動物的13種蛋白編碼基因的密碼子使用和氨基酸分布模式大多數(shù)是相類似的。只在UUC、UUU、CUC、AUC、AUU、UCU、CCG、ACA、UAA、UAG這些密碼子的使用上有明顯的區(qū),豹和貓使用CUC分別為35和57次,約為其它四個(gè)物種的三分之一到二分之一;豹使用UCU、UAA和UAG分別為113、106和151次,顯著的高于其它五個(gè)物種(表3)。

    表2 6種貓科動物13種蛋白編碼基因起始/終止密碼子使用比較

    表3 6種貓科動物13個(gè)線粒體蛋白編碼基因的密碼子使用

    續(xù)表

    2.3.2 基因的編碼方式及遺傳密碼

    所有22個(gè)tRNA基因及其反密碼子都在6種貓科物種中發(fā)現(xiàn),基因的編碼方式與核基因不同,基因的起始和終止采用極為壓縮的方式進(jìn)行連接,有時(shí)甚至重疊好幾個(gè)堿基。遺傳密碼系統(tǒng)與核基因的標(biāo)準(zhǔn)密碼有些不同,在這些遺傳編碼中,TAG編碼色氨酸(Trp)而不是終止密碼子;密碼子ATA編碼了甲硫氨酸(Met)而不是異亮氨酸(Ile);AGA作為終止密碼子再現(xiàn),而不是編碼精氨酸(Arg),這些都不同于核基因組中的密碼子利用。

    2.4 rRNA 基因

    虎、豹、雪豹、云豹、獵豹和貓線粒體12SrRNA基因位于tRNAPhe和tRNAVal之間,核苷酸序列總長度分 別 為 960、959、960、958 960 和 960bp;16S rRNA位于tRNAVal和tRNALeu(UUR)之間,核苷酸序列總長度分別為1575、1572、1580、1573、1572和1574bp。統(tǒng)計(jì)分析顯示,盡管序列的堿基組成呈現(xiàn)A-T的偏異,但A與G的含量遠(yuǎn)高于整個(gè)線粒體基因組A和G的平均含量。

    2.5 tRNA基因

    虎、豹、雪豹、云豹、獵豹和貓線粒體基因組都有22個(gè)tRNA,長度在58~77bp之間,最長的是tRNALeu(UUR))基 因,最 短 的 是tRNASer(AGY)基 因。預(yù)測的tRNA二級結(jié)構(gòu)顯示,除tRNASer(AGY)與其它脊椎動物一樣為二葉草結(jié)構(gòu),缺失了“DHU”臂[10,11]以外,其余均為典型的三葉草結(jié)構(gòu),二級結(jié)構(gòu)包括6~8bp的氨基酸接受臂,2~5bp的TΨC臂,5~7bp的反密碼子臂,4~6bp的二氫尿嘧啶臂 (DHU臂)。tRNA折疊除了有正常的堿基配對外,還有G+T配對(圖1)。在形成三葉草狀二級結(jié)構(gòu)的tRNA中,tRNASer(AGY)的“DHU”臂缺失現(xiàn)象較為普遍,脊椎動物在tRNASer(AGY)上都缺失“DHU”臂[12];而且在有袋類動物北美負(fù)鼠(Didelphisvirginiana)的tRNALys基因上也表現(xiàn)出“DHU”臂的缺失[13]。

    圖1 線粒體基因組tRNA的二級結(jié)構(gòu)示意圖(以豹為例)

    2.6 非編碼區(qū)

    虎、豹、雪豹、貓、獵豹和云豹的輕鏈復(fù)制起始(OLR)都是位于tRNAAsn和tRNACys之間,長度在32~39bp間,并不一致。OLR區(qū)域可以折疊成一個(gè)熱力學(xué)上穩(wěn)定的莖環(huán)二級結(jié)構(gòu),莖由11個(gè)核苷酸對組成,環(huán)由14個(gè)核苷酸組成,組成環(huán)的核苷酸在重鏈上以Poly(T)為主。涉及由RNA合成轉(zhuǎn)變成DNA合成的特殊片段5’-GCCGG-3’[14],在貓、獵豹、云豹、虎、豹和雪豹是完全保守的,與人的一致。OLR的莖長度完全相同,其中貓、獵豹、云豹和雪豹享用tRNACys基因的4個(gè)堿基,其在基部的11對核苷酸序列與其他脊椎動物線粒體基因組一樣是高度保守的,而環(huán)的序列變異較大(圖2)。

    圖2 6種貓科動物線粒體基因輕鏈復(fù)制起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)。圖中為重鏈序列;方框的序列表示RNA合成到DNA的合成的轉(zhuǎn)變.

    6種貓科動物mtDNA的控制區(qū)位置在tRNAPro和tRNAPhe之間,長度略有變化,但與哺乳動物的D-loop區(qū)長度相似,都在1.5kb左右??刂茀^(qū)在結(jié)構(gòu)組成上是線粒體基因組中變化最大的區(qū)域。參考Kim等[15]的研究結(jié)果,預(yù)測了6種貓科動物線粒體控制區(qū)(D-loop)的結(jié)構(gòu),包括左域(Leftdomain)、中間保守區(qū)(conserved sequenceblocks,CSB)以及右域(Rightdomain)的位置,確定了高變區(qū)(HVS)、重復(fù)序列區(qū)(RS)。在6種貓科動物的D-loop區(qū)內(nèi)存在一些微衛(wèi)星序列和重復(fù)序列(表4)。

    表4 6種貓科動物線粒體基因組控制區(qū)的比較

    3 討論

    3.1 貓科動物mtDNA堿基的組成特點(diǎn)

    貓科動物線粒體全基因組包括13個(gè)蛋白編碼基因,22個(gè)tRNA基因,2個(gè)rRNA基因和一個(gè)控制區(qū) (D-loop)。與其他的脊椎動物的mtDNA一樣,大多數(shù)基因在重鏈(H鏈)編碼,只有ND6和8個(gè)tRNA基因在輕鏈(L鏈)編碼。堿基含量的大小排列是A>T>C>G,A-T含量比G-C含量高,而且AT偏斜比GC偏斜高。

    3.2 蛋白質(zhì)編碼基因

    貓科動物線粒體基因組共有13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中,除ND6基因由L鏈編碼外,其余的均由H鏈編碼,沒有發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子,有些基因與其他基因存在少許重疊。在起始密碼子的使用上和大多數(shù)脊椎動物線粒體編碼基因常用的起始密碼子是同源的[16]。在大多數(shù)的脊椎動物中,COI基因是以GTG為起始密碼子的,而Boore等[17]認(rèn)為COI基因起始端只有GTG,沒有其它的起始形式?;趯ω埧苿游飉tDNA的研究和以前的結(jié)果,說明COI基因起始密碼子除GTG外,還有ATG[18,19]。據(jù)目前不完全統(tǒng)計(jì),脊椎動物 mtDNA編碼基因的起始密碼子種類有ATG、GTG、ATA、ATC、ATT和 ACA,在使用頻率上,ATG約占95%以上。在終止密碼子的使用上也與大多數(shù)哺乳動物的終止密碼子使用情況類似[20]。一些研究認(rèn)為,不完全終止密碼子(T或TA)是由轉(zhuǎn)錄后的 mRNA3’端的PolyA補(bǔ)齊[21],因而貓科動物線粒體基因組中的不完全終止密碼子T或TA應(yīng)補(bǔ)齊為TAA。終止密碼子AGA在六種貓科動物的Cyt b基因中出現(xiàn),這種終止方式也分別在人和牛的 COI和 Cyt b基因中出現(xiàn)[10,22];此結(jié)果說明哺乳動物線粒體Cyt b基因的終止密碼子傾向使用AGA,有別于其它類群。

    通常認(rèn)為,哺乳動物線粒體蛋白質(zhì)編碼基因密碼子的第三位點(diǎn)AT偏向性尤其明顯,在6中貓科動物中,豹在第一位點(diǎn)上表現(xiàn)出比其他5種動物更加明顯的AT偏向性,這種現(xiàn)象在其它物種中是較少為見的。尤其是第二位密碼子的堿基含量波動較大,A和C遠(yuǎn)高于整個(gè)線粒體基因組A和C的平均含量,而G的含量遠(yuǎn)低于整個(gè)線粒體基因組G的平均含量。第三密碼子在堿基使用上也出現(xiàn)較大的差異,G的含量遠(yuǎn)高于整個(gè)線粒體基因組G的平均含量。該結(jié)果表明線粒體基因組中堿基變化主要由密碼子第二、三位堿基變化造成。

    3.3 rRNA和tRNA基因

    以貓線粒體基因組中的12/16SrRNA基因的核苷酸序列作對比序列,結(jié)果顯示,虎與貓相比有119堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換、19堿基位點(diǎn)顛換;豹與貓相比有119堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換,25堿基位點(diǎn)顛換;雪豹與貓相比有113堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換,26堿基位點(diǎn)顛換;云豹與貓相比有112堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換,24堿基位點(diǎn)顛換;獵豹和貓相比126堿基位點(diǎn)轉(zhuǎn)換,21堿基位點(diǎn)顛換。分析結(jié)果顯示,虎與雪豹、豹的2個(gè)rRNA基因的同源性最高,分別為95%和94.7%,與貓的同源性次之,為93.6%;與云豹的同源性較低為93.4%,與獵豹的同源性最低為93.2%。說明12/16SrRNA基因有較高的保守性。

    在tRNAAsn和tRNACys之間存在相當(dāng)于輕鏈復(fù)制起始的發(fā)夾結(jié)構(gòu),tRNA序列變異主要發(fā)生在環(huán)區(qū),莖區(qū)相對保守。其中一些變異如雙鏈的互補(bǔ)性堿基突變、G-T配對等在所預(yù)測的貓科動物tRNA二級結(jié)構(gòu)中都有出現(xiàn),大部分堿基對符合Wasten-Click配對原則,另有一些GT變偶堿基對符合G-T擺動配對原則,這對于維系tRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到非常重要的作用。一些學(xué)者認(rèn)為線粒體基因組tRNA基因的部分錯配可以通過RNA自我剪切來恢復(fù)基因的功能,不會引起氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)上的障礙[23]。關(guān)于tRNASer(AGN)基因缺少DHU臂,這種情況在脊椎動物線粒體中比較常見。tRNASer(AGN)基因均缺少DHU臂的長度由低等無脊椎動物到高等脊椎動物逐漸變短。對哺乳動物這類tRNA的研究表明,它們可以形成潛在的L型結(jié)構(gòu)以維持反密碼子與CCA接受臂之間的距離[24],tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)特定氨基酸的功能及其L形的三級結(jié)構(gòu)主要由氨基酸臂和反密碼子環(huán)決定,而TΨC環(huán)和DHU環(huán),及其相應(yīng)的臂,似乎不會抑制tRNA 的功能[25,26]。

    3.4 控制區(qū)

    6種貓科動物的D-loop區(qū)的長度略有變化,但與哺乳動物的D-loop區(qū)長度相似,都在1.5 kb左右,但與某些脊椎動物,如兩棲類無尾目的澤蛙、黑斑蛙和非洲爪蟾的D-loop區(qū)差別較大(2kb以上)。從表4可看出6種貓科動物的D-loop區(qū)的長度并不一致。其原因主要出現(xiàn)在HVS-1、HVS-2和RS-3區(qū)域的變化上:在HVS-1區(qū),貓和獵豹的序列較長,而虎、雪豹、豹和云豹的序列則較短,分別比貓少66、119、133和189bp,比獵豹少94、138、145和200bp;在RS-3和HVS-2區(qū),虎、豹和云豹的序列較長,而貓、獵豹和雪豹的序列則較短,分別短66~149bp。6種動物在D-loop區(qū)都有許多串聯(lián)重復(fù)單元,但拷貝數(shù)及每一重復(fù)單元的長度并不一樣,但6種動物的重復(fù)序列間有著較高的相似性(表4)。這表明它們可能有著共同的起源。關(guān)于重復(fù)序列的生物學(xué)功能有兩個(gè)主要的觀點(diǎn):一種觀點(diǎn)認(rèn)為,重復(fù)序列可能在線粒體DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中起到一定的 調(diào) 控 作 用[27,28];然 而 Casane 等[29]認(rèn) 為不具有生物學(xué)功能,是一些冗余序列。這兩種觀點(diǎn)還有待于進(jìn)一步的探討。至于重復(fù)序列產(chǎn)生的機(jī)制,目前認(rèn)為是由于鏈的滑動錯配所導(dǎo)致[30,31]。另外,貓、獵豹、云豹、虎、豹、雪豹線粒體控制區(qū)的CSB—1、CSB—2區(qū)堿基序列與完全一致。在CSB—3區(qū),豹、雪豹完全相同,虎與之有一個(gè)堿基的差異(堿基G);云豹與家貓、獵豹相比存在4個(gè)堿基的差異,云豹在此區(qū)域存在4個(gè)堿基變異的現(xiàn)象,在貓科物種中極為少見,因此,這三個(gè)區(qū)域的生物學(xué)功能還有待于進(jìn)一步探討。

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