益心泰對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌鈣超載及肌漿網(wǎng)鈣泵的影響※

郭志華 吳剛強(qiáng) 申 思 齊 婧 ?？〗?常瀅瀅

(1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410208;2湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410208)

慢性心力衰竭 (chronic heart failure，CHF)是各種心臟疾病導(dǎo)致心功能不全的一種綜合征，作為一種進(jìn)展性臨床綜合征，已成為21世紀(jì)最重要的心血管疾病和心臟病治療的最大戰(zhàn)場(chǎng)［1］。因此，如何對(duì)CHF加以積極的干預(yù)顯得尤為重要。心肌重構(gòu)是CHF的病理生理基礎(chǔ)，目前Ca2+被公認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，鈣循環(huán)過(guò)程主要包括心肌肌漿網(wǎng) (sarcoplasmic reticulum，SR)鈣釋放、鈣回?cái)z、鈣儲(chǔ)存三個(gè)過(guò)程［2］。在這些過(guò)程中心肌肌漿網(wǎng)鈣泵(sarcoplasmic reticulum calcium adenodine triphosphatase2a，SERCA2a)起主要作用，它的活性和功能直接影響心肌舒縮功能［3］。本研究初步探討了益心泰對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌鈣超載及肌漿網(wǎng)鈣泵的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只健康Wistar雄性大鼠，體重200～250g，飼料為標(biāo)準(zhǔn)合成的飼料，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥品和試劑 益心泰丸 (由黃芪、紅花、丹參、葶藶子等組成)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供;培哚普利由雅施達(dá) (天津)制藥有限公司提供。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備 BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理生理實(shí)驗(yàn)室提供);微型高速離心機(jī)EBA21(德國(guó)Hettich公司);多功能酶標(biāo)儀MK-3(湖南中醫(yī)藥大學(xué)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供);數(shù)彩圖像顯微分析系統(tǒng)BTS-20M(中國(guó)華粵行公司);AEV-210電子分析天平(長(zhǎng)沙湘儀天平儀器廠);PH試紙、大鼠灌胃針、塑料導(dǎo)管、壓力換能器、動(dòng)物手術(shù)臺(tái)、手術(shù)燈和手術(shù)器械、一次性用品如棉簽、紗塊和七號(hào)注射器。

1.4 動(dòng)物造模 腹腔注射5%戊巴比妥鈉 (1～2ml/kg)麻醉大鼠。胸部去毛，仰臥位固定于解剖臺(tái)上，75%乙醇消毒手術(shù)視野。經(jīng)喉氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，行正壓人工呼吸 (潮氣量0.7～0.8ml，呼吸頻率60次/min)。用針形電極刺入四肢及胸壁皮下，描記正常心電圖 (記錄標(biāo)準(zhǔn)肢導(dǎo)聯(lián)及胸前導(dǎo)聯(lián)，紙速50mm/s)。在無(wú)菌操作下，于胸骨左側(cè)第3～4肋間橫向切開(kāi)皮膚長(zhǎng)約1.5cm的切口，鈍性分離軟組織，可見(jiàn)胸骨及肋軟骨。沿第3～4肋間隙打開(kāi)胸腔用開(kāi)胸器撐開(kāi)切口，用眼科小鑷子輕提心包膜，用眼科小剪子剪開(kāi)心包膜，暴露心臟，用鑷子輕提左心耳，于左冠狀動(dòng)脈前降支起源點(diǎn)下2～4mm處用6號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈主干造成心肌梗死。隨即逐層縫合胸壁，并于傷口處撒以注射用青霉素鈉。同時(shí)腹腔注射呋塞米0.2ml/kg及洛貝林0.2ml/kg。術(shù)后記錄標(biāo)準(zhǔn)肢導(dǎo)聯(lián)及胸前導(dǎo)聯(lián)心電圖 (紙速50mm/s)，ST段弓背抬高者為心肌梗死造模成功。待動(dòng)物恢復(fù)自主呼吸狀態(tài)平穩(wěn)后撤離呼吸機(jī)，并注射青霉素鈉4萬(wàn)ⅠU，每日1次，共1周，防止感染。常規(guī)喂養(yǎng)飼料與水7周后，大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸、心跳加快，怕冷少動(dòng)，倦怠無(wú)力，食欲不振、紫紺、皮下水腫等癥狀，超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)左室射血分?jǐn)?shù) (LVEF)＜50%，提示心衰造模成功。各組均于造模后第50天開(kāi)始給藥，每天上午灌胃1次，連續(xù)8周。

1.5 動(dòng)物分組及給藥 將造模成功的大鼠隨機(jī)分為五組:模型組10只、益心泰高劑量組10只、益心泰中劑量組10只、益心泰低劑量組10只和培哚普利組10只，另設(shè)沒(méi)有進(jìn)行造模處理的正常對(duì)照組10只，一共為6組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天上午按下列劑量灌胃給藥1次:正常組不進(jìn)行藥物干預(yù);模型組灌服同等容積的生理鹽水;益心泰丸高劑量組灌服10.5g/(kg·d);益心泰丸中劑量組灌服5.5g/(kg·d);益心泰丸低劑量組灌服2.5g/(kg·d);培哚普利組灌服4.5g/(kg·d)，均每日1次。共用藥4周。

1.6 觀察指標(biāo)及方法 ①心肌重構(gòu)指標(biāo)。左心室重量指數(shù) (LVWⅠ)、右心室重量指數(shù) (RVWⅠ)。

②鈣含量 ［Ca2+］i檢測(cè)。參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ⅠSO6490/2-1983方法，采用原子吸收分光光度儀測(cè)定心肌組織鈣含量。③肌漿網(wǎng)鈣泵 (SERCA2a)的活性檢測(cè)。參照Afzal等［4］方法提取左室心肌SR，lowry法蛋白定量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用 (均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析以P＜0.05為差異有顯著性。所有統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS16.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 用藥后各組大鼠心肌重構(gòu)指標(biāo)變化情況比較 與正常對(duì)照組比較，模型組左心室重量指數(shù)、右心室重量指數(shù)明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。與模型組比較，益心泰高、中、低劑量組和培哚普利組左室重量指數(shù)、右室重量指數(shù)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。與培哚普利組比較，益心泰中、低劑量組左、右心室重量指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);而益心泰高劑量組與培哚普利組各項(xiàng)指標(biāo)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 用藥后各組大鼠心臟重構(gòu)指標(biāo)變化情況 (χ±S)

2.2 用藥后各組心肌組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量變化比較與正常對(duì)照組比較，模型組［Ca2+］i濃度明顯升高，SERCA2a明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。與模型組比較，益心泰低、中、高劑量組和培哚普利組［Ca2+］i濃度均降低，SERCA2a明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。與培哚普利組比較，益心泰中、低劑量組［Ca2+］i濃度升高，SERCA2a明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);而益心泰高劑量組與培哚普利組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組［Ca2+］i和SERCA2a蛋白表達(dá)的比較 (χ±S)

3 討論

隨著我國(guó)社會(huì)老齡化和高血壓、冠心病等心血管疾病的發(fā)病人數(shù)逐年增多，CHF的發(fā)病率和死亡率仍呈繼續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，正在成為2l世紀(jì)最重要的心血管病癥。因此，如何對(duì)CHF加以積極的干預(yù)顯得尤為重要。心肌重構(gòu)是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率及死亡率顯著升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是心臟功能從代償期向失代償期演變及心臟結(jié)構(gòu)從可逆向不可逆發(fā)展的關(guān)鍵階段，是心功能衰竭的病理生理基礎(chǔ)。因此，防止CHF發(fā)生的關(guān)鍵在于控制心肌重構(gòu)的不良進(jìn)展。

鈣離子在心臟的生理和病理功能方面起著關(guān)鍵作用［5］。心肌細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放主要來(lái)源于肌漿網(wǎng)儲(chǔ)鈣的釋放和少量由線粒體釋放。Ca2+從肌漿網(wǎng)內(nèi)釋放出來(lái)后，與肌鈣蛋白結(jié)合，引起心肌收縮。本研究中，由于結(jié)扎了大鼠左冠狀動(dòng)脈，導(dǎo)致了左心室游壁心肌缺血，細(xì)胞外鈣內(nèi)流，同時(shí)肌漿網(wǎng)儲(chǔ)鈣的釋放，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度增高;同時(shí)由于心肌缺血缺氧，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生酸中毒，胞內(nèi)PH值下降，細(xì)胞膜Na+-H+交換通道激活，Na+-Ca2+交換通道增加，心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度增高，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載。Ca2+作為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的主要信使，導(dǎo)致相關(guān)通道發(fā)生改變，介導(dǎo)了心肌重構(gòu)的發(fā)生和進(jìn)展，最后導(dǎo)致心衰。因此細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高是心肌重構(gòu)發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［6-7］。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型組［Ca2+］i濃度明顯升高 (P＜0.05)，但用藥4周后，與模型組比較，益心泰低、中、高劑量組和培哚普利組［Ca2+］i濃度均降低，而益心泰高劑量組療效甚至與培哚普利組療效相當(dāng)，說(shuō)明益心泰確實(shí)能減輕心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，改善心肌重構(gòu)，抑制心衰的發(fā)生和進(jìn)展。

在正常情況下，在心臟舒張期，肌漿網(wǎng)鈣泵將大部分Ca2+回?cái)z至肌漿網(wǎng)內(nèi)儲(chǔ)存，但在心衰時(shí)，肌漿網(wǎng)活性減弱，回?cái)zCa2+減少，鈣儲(chǔ)存減少，從而肌漿網(wǎng)鈣容量減少，影響心肌收縮力。有研究表明［8］，SERCA2a基因療法可以改善心功能，抑制心衰的發(fā)生進(jìn)展。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型組SERCA2a明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。但用藥4周后，與模型組比較，益心泰低、中、高劑量組和培哚普利組SERCA2a明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P ＜0.05)。而益心泰高劑量組療效甚至與培哚普利組療效相當(dāng)，說(shuō)明益心泰確實(shí)能改善心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)SERCA2a活性，改善心功能。

本研究中益心泰為針對(duì)慢性心衰氣虛血瘀水停的主要病機(jī)，辨證立法，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)而組方的，本方由黃芪、紅花、丹參、澤瀉、葶藶子等組成。方中黃芪味甘性微溫，歸脾、肺經(jīng)，入氣分，可升可降，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、行水消腫、托毒生肌等功效?！侗静萸笳妗氛J(rèn)為“黃耆，味甘性溫，質(zhì)輕皮黃肉白，故能入肺補(bǔ)氣，入表實(shí)衛(wèi)，為補(bǔ)氣諸藥之最，是以有耆之稱(chēng)?！庇醒芯匡@示，黃芪總提取物及有效成分能明顯增加心衰大鼠的心肌收縮力，改善心功能［9］。紅花味辛性溫，歸心、肝經(jīng)，氣香行散，入血分，具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，紅花對(duì)反復(fù)短暫阻斷冠狀動(dòng)脈血流造成的犬急性心肌缺血有明顯減輕作用，可使缺血范圍減少，心率減慢，縮小梗死面積，改善心肌氧供。丹參味苦微辛性微寒，歸心、肝經(jīng)，色赤入血，為活血化瘀的要藥，前人有“丹參一味，功同四物”之說(shuō)，其功在于活血行血，內(nèi)達(dá)臟腑而化瘀滯?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，丹參可改善心臟舒張功能，從而提高心臟收縮功能，對(duì)缺氧引起的心肌損傷有一定的保護(hù)作用，同時(shí)能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。葶藶子味辛、苦，性大寒，歸肺、膀胱經(jīng)。具有瀉肺平喘，行水消腫功效。全方以補(bǔ)氣、活血、利水為主，通過(guò)益氣、活血，達(dá)到補(bǔ)其虛祛其瘀利其水而治療慢性心力衰竭的目的。

綜上所述，益心泰治療CHF療效確切，不僅可以抑制心衰大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載，而且還可以上調(diào)SER-CA2a表達(dá)改善心功能，這可能也是益心泰抑制心肌重構(gòu)、改善心衰的機(jī)制之一。

［1］Bamani GV，Uber PA，Mehra MR.Chronic heart failure:contemporary diagaosis and management［J］.Mayo Clin Prec，2010，85(2):180-195.

［2］Dibb KM，Graham HK，Venetucci LA，et al.Analysis of cellular calcium fluxes in cardiac muscle to understand calcium homeostasis in the heart［J］.Cell Calcium，2007，42:503-512.

［3］Ⅰnesi G，Prasad AM，Pilankatta R.The Ca(2+)ATPase of cardiac sarcoplasmic reticulum:hysiological role and relevance to diseases［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，369:182-187.

［4］Afzal N，Dhalla NS.Different changes in left and right ventricular SR calcium transport in congestive heart failure［J］.Am J Physiol，1992，262(4):868.

［5］Griffiths EJ，Balaska D，Cheng WH.The ups and downs of mitochondrial calcium signalling in the heart［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1797(6-7):856-864.

［6］Wilkins BJ，Dai YS，Bueno OF，et al.Decreased cardiac L-type Ca2+channel activity induces hypertrophy and heart failure in mice［J］.J Clin Ⅰnvest，2012，122(1):280-290.

［7］王照華，李永勝，楊樂(lè).丹參酮對(duì)肥厚心肌組織中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的影響［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8(29):18-21.

［8］Kumarswamy R，Lyon AR，Volkmann Ⅰ，et al.SERCA2a gene therapy restores microRNA-1 expression in heart failure via an Akt/FoxO3A-dependent pathway，2012，33(9):1067-1075.

［9］王玉敏，馬琰巖，高俊虹，等.黃芪總提物及其有效成分改善阿霉素致心衰的研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(7):208-212.