香菇多糖對幼建鯉腸道菌群數(shù)量及非特異性免疫指標(biāo)的影響

黃小麗,鄧永強(qiáng),汪開毓,杜宗君,耿毅,陳德芳

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,四川雅安625014;2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心,四川成都610041;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,四川雅安625014)

香菇多糖對幼建鯉腸道菌群數(shù)量及非特異性免疫指標(biāo)的影響

黃小麗1,鄧永強(qiáng)2,汪開毓3,杜宗君1,耿毅3,陳德芳1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,四川雅安625014;2.四川省動物疫病預(yù)防控制中心,四川成都610041;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,四川雅安625014)

在基礎(chǔ)飼料中添加0、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 g/kg(飼料)的香菇多糖,連續(xù)飼喂體質(zhì)量為(40.0±0.5)g的建鯉Cyprinus carpio var.Jian 49 d后,檢測香菇多糖對幼建鯉主要腸道菌群數(shù)量及部分非特異性免疫指標(biāo)的影響。結(jié)果表明:飼喂各試驗(yàn)劑量的香菇多糖均能極顯著地提高幼建鯉的白細(xì)胞殺菌活性和血清中溶菌酶活性 (P＜0.01);飼喂1.6 g/kg(飼料)及以上劑量的香菇多糖,可使幼建鯉前、中、后腸中的乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量較對照組極顯著增加 (P＜0.01),且以2.4 g/kg(飼料)劑量組的刺激效果較佳;飼喂1.2 g/kg(飼料)及以上劑量的香菇多糖,可使幼建鯉前、中、后腸中的大腸桿菌、嗜水氣單胞菌數(shù)量較對照組極顯著減少(P＜0.01),分別以2.0、2.4 g/kg(飼料)劑量組的刺激效果較佳。

香菇多糖;建鯉;腸道菌群;非特異性免疫;白細(xì)胞殺菌活性;溶菌酶

香菇多糖 (lentinan,LNT)是從擔(dān)子菌綱、傘菌科、真菌香菇Lentinus edodes子實(shí)體中提取的一種以β-D-(1,3)葡萄糖殘基為主鏈,β-D-(1,6)葡萄糖殘基或β-D-(1,3)葡萄糖殘基為側(cè)鏈構(gòu)成的葡聚糖[1-2],具有抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)干擾素生成等功能[3-4],被廣泛應(yīng)用于人類多種腫瘤疾病的治療[5]。目前,香菇多糖的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大,在畜禽[6-8]、水產(chǎn)[9-13]等領(lǐng)域的諸多研究結(jié)果表明,香菇多糖能有效地改善動物機(jī)體的免疫功能。

香菇多糖對鯉腸道菌群和非特異性免疫的影響研究目前尚未見報(bào)道,為此,作者探討了飼喂添加香菇多糖的飼料對幼建鯉 Cyprinus carpio var.Jian腸道菌群和部分非特異性免疫指標(biāo)的影響,旨在為香菇多糖在水生動物飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用建鯉為同一批次健康的建鯉幼魚 (幼建鯉)900尾。試驗(yàn)用香菇多糖購自浙江方格藥業(yè)有限公司,多糖含量為50%。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 幼建鯉購回后馴化養(yǎng)殖30 d,體質(zhì)量為 (40.0±0.5)g,馴化結(jié)束后開始正式試驗(yàn)。隨機(jī)將 900尾幼建鯉分成 6組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組),每組設(shè)3個重復(fù),每個重復(fù)放50尾魚,分別飼喂香菇多糖添加量為0、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 g/kg的飼料,試驗(yàn)共進(jìn)行49 d。

將幼建鯉飼養(yǎng)于溫室水族箱中,水源為曝氣自來水。試驗(yàn)期間水溫為 (25±1)℃,pH為7.0左右,溶解氧為6 mg/L以上。試驗(yàn)期間每天9:00和17:00定時投喂,并根據(jù)幼建鯉的攝食量、水溫條件即時調(diào)整投喂量,以所有的魚飽食為準(zhǔn)。

1.2.2 腸道菌群數(shù)量的測定 試驗(yàn)結(jié)束后,從每組魚中隨機(jī)選取9尾體質(zhì)量相近的建鯉,魚體表用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒,解剖去除腸道周圍脂肪組織,以無菌生理鹽水淋洗腸壁,在無菌條件下分別取前、中、后腸內(nèi)容物,將每3尾魚的腸道內(nèi)容物作為一個樣本,將其放入帶有玻璃珠的三角瓶中,稱重后加入10倍質(zhì)量的無菌生理鹽水,置于搖床上,以230 r/min振蕩10 min,再依次以10倍梯度稀釋,選擇合適的稀釋度,分別滴加在雙岐桿菌培養(yǎng)基 (BBL)、乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(MRS)、大腸桿菌伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基 (EMB)、嗜水氣單胞菌選擇培養(yǎng)基 (RB)上,每個樣品設(shè)3個重復(fù),于28℃下培養(yǎng),用乳酸桿菌和雙歧桿菌厭氧培養(yǎng)72 h,其余需氧培養(yǎng)24 h后計(jì)算菌落數(shù),細(xì)菌計(jì)數(shù)采用平板涂布法,并以lg[cfu/g(腸道內(nèi)容物)]表示。

1.2.3 免疫相關(guān)指標(biāo)的測定

1)白細(xì)胞懸液的制備。取1.0 mL抗凝血緩慢加入至1.5 mL相對質(zhì)量密度為1.070的淋巴細(xì)胞分離液中,以2 500 r/min離心15 min,吸取白細(xì)胞層,以Hank's液重懸,并計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×107個/mL[14]。用臺盼藍(lán)染色檢測白細(xì)胞的存活率,活細(xì)胞數(shù)不少于90%[15]。

2)白細(xì)胞的殺菌活性。試驗(yàn)結(jié)束后,從每個處理組中隨機(jī)選取建鯉5尾,尾靜脈采血。血液經(jīng)肝素鈉抗凝處理,在離心管中加淋巴細(xì)胞分離液0.8 mL,向管中緩慢加入抗凝血液 (不能搖勻),以2 500 r/min離心15 min,用注射器于白細(xì)胞層取細(xì)胞液0.5 mL,加入至4 mL的離心管中,再加入0.1 mL濃度為1.0×108cfu/mL的金黃色葡萄球菌液,混勻后置于28℃水浴中孵育1 h,以2 000 r/min離心10 min,棄上清液,加入0.5 mL Hank's液重懸。在相同溫度條件下繼續(xù)孵育 80、100、120 min,定時從中吸取0.2 mL細(xì)胞懸液于另一試管中,加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)為0.2%的Tween-20破碎白細(xì)胞,并加入0.5 mL MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h,再加入0.06 mL 5.0 mg/mL的MTT(四甲基偶氮唑鹽),均勻搖動15 min,用分光光度計(jì)在600 nm波長處測定吸光度 (OD)[16]。按下列公式計(jì)算殺菌指數(shù) (BI):

其中:tx為孵育時間;t0為孵育前時間。當(dāng) BI＜1.0時,具有殺菌能力;當(dāng)BI＞1.0時,則無殺菌能力。即BI值升高,殺菌能力降低,反之亦然。

3)血清溶菌酶活性。從每個處理中隨機(jī)選取5尾魚,尾靜脈采血。血液置于冰箱 (4℃)中靜置過夜,次日低溫下以3 000 r/min離心血清,并按照溶菌酶試劑盒 (浙江伊利康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))說明書方法測定血清中的溶菌酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼喂香菇多糖對幼建鯉腸道主要菌群數(shù)量的影響

從表1可見:飼喂本試驗(yàn)劑量的香菇多糖對幼建鯉前、中、后腸中的乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均有不同程度的增加作用,飼喂1.6 g/kg(飼料)及以上劑量時,乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量較對照組均有極顯著增加 (P＜0.01),且均以2.0 g/kg (飼料)劑量組的刺激效果較佳。

從表2可見:飼喂本試驗(yàn)劑量的香菇多糖對幼建鯉前、中、后腸中的大腸桿菌和嗜水氣單胞菌數(shù)量均有不同程度的降低作用,飼喂1.2 g/kg(飼料)及以上劑量時,大腸桿菌數(shù)量較對照組極顯著降低 (P＜0.01),飼喂2.4 g/kg(飼料)劑量時,嗜水氣單胞菌數(shù)量較對照組極顯著降低 (P＜0.01),分別以2.0 g/kg(飼料)和2.4 g/kg(飼料)劑量組的刺激效果較佳。

2.2 飼喂香菇多糖對幼建鯉白細(xì)胞殺菌活性和血清中溶菌酶活性的影響

從表3可見:飼喂各試驗(yàn)劑量的香菇多糖均能極顯著提高幼建鯉的白細(xì)胞殺菌活性和血清中的溶菌酶活性 (P＜0.01)。其中,以2.0 g/kg(飼料)劑量 (Ⅴ組)的白細(xì)胞殺菌活性最高,與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ組差異極顯著 (P＜0.01),且與Ⅳ組差異顯著 (P＜0.05);Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組的血清溶菌酶活性極顯著高于Ⅰ、Ⅱ組 (P＜0.01),與Ⅲ組差異顯著(P＜0.05),但Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組之間差異不顯著 (P＞0.05)。

3 討論

研究表明,不同魚類腸道微生物種類各異[17-19],而定植于鯉腸道中的大腸桿菌、乳酸桿菌、雙岐桿菌和嗜水氣單胞菌是鯉消化道內(nèi)幾種主要的微生物菌群[20-21]。乳酸桿菌和雙歧桿菌作為鯉腸道中的益生菌,通過降低腸道pH值或通過在空間、營養(yǎng)上的屏蔽競爭作用來抑制有害菌在腸道中的定植和生長,并與其他正常菌群構(gòu)成了阻止外源性病原菌入侵定植的屏障,維持了鯉消化道菌群結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡,同時還可以產(chǎn)生細(xì)菌素以抵制有害菌的生長[22-23]。當(dāng)外源性因素作用后,可改變?nèi)樗釛U菌和雙歧桿菌的數(shù)量,從而達(dá)到提高魚類免疫能力、預(yù)防疾病的目的。李云蘭[24]研究發(fā)現(xiàn),在飼料中添加不同劑量的甘露糖,能顯著增加幼建鯉中、后腸雙歧桿菌及前、中、后腸乳酸桿菌的數(shù)量,極大地提高鯉的免疫功能。Robertson等[25]將一株從大西洋鮭腸道中分離到的肉桿菌飼喂大西洋鮭幼魚,肉桿菌能在幼魚腸道內(nèi)停止投喂后存活4～10 d,并能幫助幼魚增強(qiáng)抵御病原菌侵蝕的能力。Do-Hyung等[26]給虹鱒投喂益生菌后,能顯著增加試驗(yàn)組動物的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。Wang等[27]在鯉飼料中添加芽孢桿菌后能明顯提高試驗(yàn)組魚的生長性能、飼料轉(zhuǎn)化率和消化酶活性。而本研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)在飼料中添加香菇多糖后能明顯提高幼建鯉前、中、后腸乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量。高濃度香菇多糖 (2.0 g/kg)更能明顯地增

加前、中、后腸乳酸桿菌、雙歧桿菌的數(shù)量,但增加量并不隨香菇多糖的增加而進(jìn)一步明顯增多,試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為試驗(yàn)Ⅴ、Ⅵ組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ差異極顯著 (P＜0.01),但Ⅴ、Ⅵ組間差異不顯著 (P＞0.05)。

表1 香菇多糖對幼建鯉腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量的影響 (n=3)Tab.1 Effects of lentinan on Lactobacilli and Bifidobacterium amount in the intestinal tract of juvenile Jian common carp lg(cfu/g)

表2 香菇多糖對幼建鯉腸道大腸桿菌、嗜水氣單胞菌數(shù)量的影響 (n=3)Tab.2 Effects of lentinan on Escherichia coli and Aeromonas hydrophila amount in the intestinal tract of juvenile Jian common carp lg(cfu/g)

表3 香菇多糖對幼建鯉白細(xì)胞殺菌活性、血清溶菌酶活性的影響Tab.3 Effects of lentinan on bactericidal activity of leucocyte and serum lysozyme activity in juvenile Jian common carp U/mL

大腸桿菌屬于鯉腸道內(nèi)的正常菌群之一,因可液化明膠,不產(chǎn)生吲哚而與陸生動物的大腸桿菌略有區(qū)別。一些外源性因素可破壞鯉消化道菌群結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡,導(dǎo)致其數(shù)量大量增加,并對鯉的正常消化道環(huán)境造成嚴(yán)重破壞。嗜水氣單胞菌屬于條件致病菌,正常情況下在腸道定植的數(shù)量處于動態(tài)平衡,但外源性因素的作用可使其數(shù)量迅速增加,引起魚類的消化道功能紊亂,增加魚類患病幾率。有研究表明,飼料中添加不同營養(yǎng)物質(zhì)或藥物,均能影響大腸桿菌和嗜水氣單胞菌的數(shù)量[28-29]。Silva等[30]在飼料中添加羽扇豆和菜籽粉后,能明顯增加金鯽腸道內(nèi)嗜水氣單胞菌的數(shù)量,引起腸道菌群紊亂。同時,乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的增加在一定程度上抑制了大腸桿菌和嗜水氣單胞菌的生長。Sreekumar等[31]研究表明,乳酸桿菌不僅能在體外表現(xiàn)出明顯的抑制大腸桿菌的作用,而且在給予試驗(yàn)小鼠乳酸桿菌后,能讓大腸桿菌非感染鼠和感染鼠均出現(xiàn)腸道大腸桿菌數(shù)量降低,細(xì)菌生長受到明顯抑制。而本試驗(yàn)在飼料中添加不同劑量香菇多糖后,在增加腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的同時,也能明顯降低腸道內(nèi)大腸桿菌和嗜水氣單胞菌的數(shù)量。低劑量 (1.2 g/kg)的香菇多糖就能有效降低幼建鯉前、中腸大腸桿菌數(shù)量,但隨著劑量的增加,對大腸桿菌數(shù)量的影響不顯著 (P＞0.05)。

香菇多糖通過激活宿主免疫細(xì)胞如 T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞而起到延長生存期,輔助治療癌癥等抗癌作用[32]。在體外,香菇多糖能有效促進(jìn)離體培養(yǎng)鯉免疫細(xì)胞的活性增殖[13],能提高黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞氮呼吸暴發(fā)活性,顯著提高黃顙魚外周血白細(xì)胞的增殖能力[12]。香菇多糖主要通過激活免疫細(xì)胞,使其釋放細(xì)胞因子或刺激產(chǎn)生化學(xué)信使而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[33-34]。本研究中發(fā)現(xiàn),香菇多糖能有效增強(qiáng)幼建鯉白細(xì)胞殺菌活性和血清溶菌酶吞噬活性,對鯉非特異性免疫指標(biāo)影響明顯,是一種具有較大應(yīng)用潛力的漁用中草藥免疫增強(qiáng)劑。相關(guān)的免疫刺激機(jī)理需進(jìn)一步深入研究。

不同種類的水生動物飼料中香菇多糖的添加量略有不同。本試驗(yàn)中,香菇多糖在飼料中的添加量是在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定的。而白東清等[12]在黃顙魚飼料中各組香菇多糖的添加量分別為300、600、900、1 200、1 500 mg/kg,與本試驗(yàn)結(jié)果存在一定差異。

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The influence of lentinan on intestinal microflora and nonspecific immunity of juvenile Jian common carp Cyprinus carpio var.Jian

HUANG Xiao-li1,DENG Yong-qiang2,WANG Kai-yu3,DU Zong-jun1,GENG Yi3,CHEN De-fang1
(1.College of Animal Science&Technology,Sichuan Agricultural University,Ya'an 625014,China;2.Sichuan Provincial Center for Animal Disease Prevention and Control,Chengdu 610041,China;3.College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Ya'an 625014,China)

The intestinal microflora and nonspecific immune indexes were investigated in juvenile Jian common carp Cyprinus carpio var.Jian with body weight of(40.0±0.5)g fed diets containing various levels of lentinan(0, 0.8,1.2,1.6,2.0,and 2.4 g/kg diet)for 49 days.The results showed that the leukocyte bactericidal index and serum lysozyme activity were found very significant increase compared with the control group(P＜0.01).There were significantly more Lactobacilli and Bifidobacterium in the foregut,midgut and hindgut in the fish fed the diet containing lentinan up to 1.6 g/kg diet compared with the fish in the control group,the maximum in the fish fed the diet containing lentinan at a dose of 2.4 g/kg diet.On the other hand,Escherichia coli and Aeromonas hydrophila in the foregut,midgut and hindgut was found to be significantly decreased(P＜0.01)in number,with the optimal effective concentration of 2.0 g/kg,and 2.4 g/kg,respectively.

lentinan;Cyprinus carpio var.Jian;intestinal microflora;nonspecific immunity;leucocyte bactericidal activity;lysozyme

Q959.468

:A

2095-1388(2013)04-0329-05

2012-10-18

四川省教育廳青年基金資助項(xiàng)目 (09ZB055)

黃小麗 (1979-),女,博士,副教授。E-mail:hxldyq@126.com