光棘球海膽CYP17基因的SNPs標(biāo)記篩選及遺傳分析

朱琳琳,王秀利,王洪迪,郭曉黎,常亞青,劉洋,仇雪梅

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連116023)

光棘球海膽CYP17基因的SNPs標(biāo)記篩選及遺傳分析

朱琳琳1、2,王秀利1、2,王洪迪2,郭曉黎2,常亞青1、2,劉洋1,仇雪梅1、2

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,遼寧大連116023)

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (PCR-SSCP)技術(shù)和基因測序方法篩選光棘球海膽Strongylocentrotus nudus細胞色素17α羥化酶/17,20裂解酶 (17α-hydroxylase/17,20-lyase,CYP17)基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性 (SNPs),并進行了基于SNPs的遺傳分析。結(jié)果表明:在CYP17基因的270、417、666 nt處均發(fā)生了堿基的點突變,即G270A、A417G和C666T,前兩個突變位點位于引物對BF/BR的擴增產(chǎn)物中,后一個突變位點位于引物對CF/CR的擴增產(chǎn)物中;引物對BF/BR的擴增產(chǎn)物可形成3種基因型,即AA、BB和AB基因型,A和B等位基因頻率分別為0.54和0.46,AA、AB和BB基因型頻率分別為0.30、0.48和0.22,該座位的雜合度 (He)、純合度 (Ho)、多態(tài)性信息含量 (PIC)和有效等位基因數(shù) (Na)分別為0.496 8、0.503 2、0.373 4和1.987 3;引物對CF/CR的擴增產(chǎn)物形成了兩種基因型,即CC和CD基因型,C和D等位基因頻率分別為0.68和0.32,CC和CD基因型頻率分別為0.84和0.16,該座位的He、Ho、PIC和Na分別為0.268 8、0.731 2、0.232 7和1.367 6。遺傳變異分析結(jié)果表明:兩個座位均屬于低度多態(tài)性,而且群體遺傳雜合度較低,這反映了該群體的遺傳一致性較高。本研究篩選的3個SNPs為今后CYP17基因在光棘球海膽性腺生長發(fā)育研究上提供了前期科研基礎(chǔ)。

光棘球海膽;CYP17基因;單核苷酸多態(tài)性;遺傳分析

海膽不僅是重要的模式生物,也是重要的海水養(yǎng)殖動物。光棘球海膽Strongylocentrotus nudus、蝦夷馬糞海膽 Strongylocentrotus intermedius等已成為中國北方沿海養(yǎng)殖的重要海珍品[1]。因海膽的主要產(chǎn)品為生殖腺,其生殖腺具有豐富的營養(yǎng)和藥用價值,因此,部分學(xué)者開展了有關(guān)海膽生殖腺生長發(fā)育、基因克隆表達等方面的研究。如關(guān)于光棘球海膽生殖周期的研究[2],中間球海膽精子超低溫冷凍損傷及冷凍保存方法的研究[3-4],海膽性腺氨基酸及脂肪酸的組成分析[5-6],蝦夷馬糞海膽性腺cDNA文庫的構(gòu)建以及不同家系和性別間性腺性狀的比較[7-8],蝦夷馬糞海膽表型性狀對性腺性狀的影響效果分析[9],MYP基因在中間球海膽及雜交海膽生殖腺不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄表達[10]等。

CYP17是細胞色素P450家族的重要成員之一,該基因編碼的細胞色素17α羥化酶/17,20裂解酶 (17α-hydroxylase/17,20-lyase,CYP17)是類固醇激素合成的關(guān)鍵酶之一,對生殖腺的生長和發(fā)育起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[11-15]。本研究中,作者對光棘球海膽 CYP17基因進行了單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的篩選及遺傳學(xué)分析,旨在為今后利用SNPs分子標(biāo)記輔助培育光棘球海膽的優(yōu)良品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用光棘球海膽隨機采自大連塔河灣海域自然群體,共100枚。活體解剖取出部分海膽性腺組織,于體積分數(shù)為70%的酒精中保存,備用于基因組DNA的提取。

引物由寶生物工程(大連)有限公司合成;rTaq DNA聚合酶、dNTPs、PMDT-19載體、DNA切膠回收試劑盒等均購自寶生物工程 (大連)有限公司;其他常規(guī)試劑來自大連海洋大學(xué)基因工程實驗室。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用常規(guī)酚-氯仿法提取光棘球海膽基因組DNA[16],用TE緩沖液溶解并于4℃下保存。

1.2.2 引物設(shè)計 利用本課題組克隆的光棘球海膽CYP17基因 cDNA序列 (GenBank注冊號: GU238422)[17],在其外顯子部分設(shè)計了6對適于PCR-SSCP分析的引物,用于SNP分析。這6對引物序列如表1所示。.

表1 用于PCR-SSCP分析的CYP17基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of CYP17 gene used in PCRSSCP analysis

1.2.3 PCR擴增 參照文獻 [18]、[19]中的方法進行PCR擴增。PCR擴增體系為25 μL,其中包括模板DNA約50 ng,上、下游引物各1 μL(25 pmol/L),10×PCR緩沖液 (Mg2+plus)2.5 μL, dNTPs Mixture 2 μL,rTaq 1.5 U,加雙蒸水補至25 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃下預(yù)變性5 min;94℃下變性30 s,退火 (退火溫度如表1所示)45 s,72℃下延伸30 s,共進行30個循環(huán);最后在72℃下延伸7 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物質(zhì)量,以此決定下一步在單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (SSCP)分析中PCR產(chǎn)物的用量。

1.2.4 SSCP分析 參照文獻 [18]、 [19]中的方法進行SSCP分析。在干凈的PCR管中加入5 μL上樣緩沖液 (98%去離子甲酰胺,0.025%溴酚藍,0.025%二甲苯青,10 mml/L pH 8.0的EDTA,2%甘油)和1～2 μL PCR擴增產(chǎn)物,于98℃下變性10 min后,立即冰浴10 min。變性后的PCR產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE 30%,Acr∶Bis=29∶1)電泳,在110 V下預(yù)電泳30 min,在120 V下電泳12～14 h,用硝酸銀顯色后,判別基因型并掃描保存。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的回收和測序 對SSCP分析后的純合基因型,各取其3個個體的PCR產(chǎn)物,經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收后,連接到pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。經(jīng)菌液PCR檢測驗證后,提取重組質(zhì)粒,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

1.2.6 序列分析 利用DNAStar軟件對測序結(jié)果進行拼接與分析,并進一步確認SNPs位點。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用遺傳信息多樣性分析軟件 (PopGene 32)和多態(tài)性信息含量計算軟件 (PIC-Calc 0.6)計算群體遺傳多樣性指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP分析

以光棘球海膽基因組DNA為模板,用表1所示的6對引物進行PCR-SSCP分析。6對引物全部獲得清晰且與預(yù)期一致的PCR產(chǎn)物。其中引物對BF/BR的PCR產(chǎn)物的SSCP結(jié)果顯示出3種基因型,AA、BB和AB;引物對CF/CR的PCR產(chǎn)物的SSCP結(jié)果顯示出2種基因型,CC和CD(圖1)。

圖1 引物BF/BR和CF/CR的PCR擴增產(chǎn)物的SSCP分析Fig.1 SSCP analysis on PCR product of primers BF/ BR and CF/CR

2.2 克隆測序

將存在PCR-SSCP多態(tài)的兩對引物BF/BR、CF/CR所得到的PCR片段經(jīng)連接載體后進行測序。引物對BF/BR的PCR片段的測序峰見圖2-A、B,存在2個SNPs,即光棘球海膽CYP17基因cDNA序列的第270個核苷酸G突變?yōu)锳(圖2-A),以及第417個核苷酸A突變?yōu)镚(圖2-B)。引物CF/CR的PCR片段的測序峰圖見圖2-C,存在1個SNP,即第666個核苷酸C突變?yōu)門。上述編碼區(qū)中存在3個SNPs,但都在密碼子的第三位,沒有發(fā)生氨基酸的改變。

圖2 AA和BB基因型第270 nt(A)、第417 nt(B)處突變測序以及CC和DD基因型第666 nt(C)處突變測序結(jié)果Fig.2 Sequences of mutation at 270 nt(A)and 417 nt(B)in genotypes AA and BB,and sequences of mutation at 666 nt(C)in genotypes CC and DD

2.3 遺傳與多樣性分析

基于引物對BF/BR和CF/CR,對本試驗所采集的光棘球海膽群體進行了遺傳與多樣性分析,結(jié)果見表2。由表2可知,基于引物對BF/BR,該群體的等位基因頻率A和B分別為0.54和0.46, AA、AB和BB基因型頻率分別為0.30、0.48和0.22;雜合個體的比例占48%,而純合型個體比例較低,僅占22%;該群體的多態(tài)性信息含量較低,有效等位基因數(shù)較少,雜合度為0.496 8?；谝飳F/CR,該群體的等位基因頻率C和D分別為0.84和0.16,CC和CD基因型頻率分別為0.68和0.32;在群體中沒有出現(xiàn)DD基因型純合個體,雜合個體的比例偏低;該群體的多態(tài)性信息含量很低 (0.232 7),有效等位基因數(shù)較少,雜合度為0.268 8。

3 討論

SNPs分子標(biāo)記的出現(xiàn)極大地促進了遺傳學(xué)、基因組學(xué)和育種學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。因SNPs與動植物的生長、發(fā)育、抗病等經(jīng)濟性狀有直接或間接的相關(guān)性,選擇與海膽生殖腺生長發(fā)育有關(guān)的功能基因或候選基因篩選和研究SNPs,并在今后育種和生產(chǎn)工作中利用SNPs,具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。近幾年來,科研工作者開始發(fā)掘、研究與應(yīng)用SNPs,在水產(chǎn)動物遺傳育種方面取得了部分成果[18-26]。仇雪梅等[18]對蝦夷馬糞海膽CYP51基因的cDNA序列進行了克隆和SNPs分析,結(jié)果表明,在蝦夷馬糞海膽CYP51基因的開放閱讀框第161個核苷酸處存在1個 SNP(即A161G),該SNP與蝦夷馬糞海膽的體質(zhì)量、性腺質(zhì)量兩個生長性狀之間存在顯著相關(guān)性。郭曉黎等[19]克隆了蝦夷馬糞海膽的CYP17基因,并進行了表達差異分析,結(jié)果表明,CYP17基因在蝦夷馬糞海膽不同家系海膽雌、雄個體生殖腺轉(zhuǎn)錄水平上的表達差異明顯,雄性的表達量明顯比雌性高。本課題組已成功地克隆了光棘球海膽CYP17基因的cDNA序列[17],這為進一步開展光棘球海膽生殖腺生長發(fā)育候選基因CYP17的SNPs篩選與遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。

表2 基于引物BF/BR和CF/CR的遺傳多樣性分析Tab.2 Analysis of genetic diversity on primer pairs BF/BR and CF/CR

本研究中通過PCR-SSCP技術(shù)和DNA測序等方法篩選光棘球海膽CYP17基因的SNPs位點,發(fā)現(xiàn)在該基因270、417、666 nt處存在SNPs。三處的點突變雖然均未引起氨基酸的改變,為同義突變,但CYP17基因的這3個SNPs可能與光棘球海膽生殖腺的生長發(fā)育有關(guān)。今后可對這3個SNPs與光棘球海膽生殖腺的生長發(fā)育性狀的相關(guān)性做進一步分析。3個基因分型顯示,在BF/BR引物擴增產(chǎn)物中有AA、AB和BB 3種基因型,等位基因A和B的基因頻率接近1∶1,雜合個體占48%。在CF/CR引物擴增產(chǎn)物中有CC和CD兩種基因型,等位基因C的基因頻率是D基因頻率的5.25倍,純合個體是雜合個體的2.125倍。在基于CF/ CR引物所進行的遺傳分析中,未發(fā)現(xiàn)DD純合型個體,究其原因,可能是試驗樣本數(shù)還不夠大,以致未檢測到另一種純合型,今后可以通過擴大樣本予以驗證。

從群體遺傳多態(tài)性角度進行分析,如果多態(tài)性信息含量 (PIC)高,等位基因數(shù)目多,雜合度大,表明該群體在該座位的遺傳變異程度高。當(dāng)PIC＞0.5時,該座位為高度多態(tài)性;當(dāng)0.5＞PIC＞0.25時,該座位為中度多態(tài)性;當(dāng)PIC＜0.25時,該座位為低度多態(tài)性。本研究中,基于BF/BR引物所獲的SNPs來分析光棘球海膽群體的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)該群體個體間屬中度多樣性;基于CF/ CR引物所獲的SNPs來分析遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)該群體個體間屬低度多樣性,但兩個突變位點都屬于低度多態(tài)性,而且群體雜合度都較低,說明群體的遺傳一致性較高。本研究中篩選的3個SNPs為今后CYP17基因在光棘球海膽性腺生長發(fā)育研究上提供了前期科研基礎(chǔ)。

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SNPs screening and genetic analysis of CYP17 gene in sea urchin Strongylocentrotus nudus

ZHU Lin-lin1,2,WANG Xiu-li1,2,WANG Hong-di2,GUO Xiao-li2, CHANG Ya-qing1,2,LIU Yang2,QIU Xue-mei1,2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023, China;2.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

SNPs of 17α-hydroxylase/17,20-lyase gene were detected by PCR-single strand conformation polymorphism and genetic diversity was analyzed based on the SNPs in sea urchin Strongylocentrotus nudus.The results showed that there were three SNPs in the 270 nt nucleotide,the 417 nt nucleotide and the 666 nt nucleotide of open reading frame of CYP17 cDNA,namely G270A,A417G and C666T.The first tow mutations were found in primer pairs BF/BR,and the last mutation was located in primer pairs CF/CR.The PCR production of primer pairs BF/ BR formed genotypic AA,BB and AB,with frequency of 0.54 in Allele A and 0.46 in Allele B.The frequencies were found 0.30 in genotypic AA,0.48 in genotypic BB and 0.22 in genotypic AB.The primer pairs BF/BR revealed that the heterozygosity was 0.496 8,homozygosity 0.503 2,polymorphism information content 0.373 4 and 1.987 3 allele number of the locus.Similarly,the PCR production of primer pairs CF/CR formed genotypic CC and CD with the frequencies of 0.68 in Allele C and 0.32 in Allele D.The genotypic CC had frequency of 0.84 and the CD showed requency of 0.16.By the primer pairs CF/CR,there were the heterozygosity of 0.268 8,homozygosity of 0.731 2,polymorphism information content of 0.232 7 and the locus allele number of 1.367 6.The genetic analysis indicated that the two loci belonged to lower PIC,and the population heterozygosity was lower,with higher genetic consistency.The three SNPs are the base for further study of CYP17 gene in the sea urchin growth and development in future.

Strongylocentrotus nudus;17α-hydroxylase/17,20-lyase gene;single nucleotide polymorphisms;genetic analysis

S917

:A

2095-1388(2013)04-0373-05

2013-05-14

國家 “863”計劃重大項目 (2012AA10A412);國家自然科學(xué)基金資助項目 (31101923);遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(20102043);遼寧省百千萬人才工程項目 (2010921093);大連海洋大學(xué)科研項目 (2012HYDX02)

朱琳琳 (1987-),女,碩士研究生。E-mail:zhulinlinxuxu@163.com

王秀利 (1964-),男,博士,教授。E-mail:xlwang@dlou.edu.cn