4株瓊膠降解菌的分離、鑒定及產(chǎn)酶條件分析

牟宗娟,李貴陽(yáng),茅云翔,孔凡娜,莫照蘭

(1.中國(guó)海洋大學(xué) 海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院 黃海水產(chǎn)研究所,海水養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071;3.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071)

瓊膠酶能水解瓊膠多糖產(chǎn)生具有多種生理活性的瓊膠寡糖,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工領(lǐng)域。瓊膠酶在生物學(xué)領(lǐng)域也有重要的用途,用于制備海藻單細(xì)胞和原生質(zhì)體、回收DNA、研究海藻細(xì)胞壁多糖組成和結(jié)構(gòu)等[1]。瓊膠酶分為 α-瓊膠酶(EC3.2.1)和 β-瓊膠酶(EC3.2.1.81)兩類(lèi),來(lái)源于海洋、淡水和陸地土壤微生物。不同種屬細(xì)菌、同種細(xì)菌不同菌株甚至同株細(xì)菌可以產(chǎn)生不同的瓊膠酶,其降解產(chǎn)物也有不同。如從假單胞菌和交替單胞菌產(chǎn)生的β-瓊膠酶,降解產(chǎn)物分別為新瓊二糖[2]和新瓊四糖[3];假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas sp.)細(xì)菌 CY24產(chǎn)生兩種β-瓊膠酶,其降解產(chǎn)物不同[4-5]。海洋細(xì)菌是產(chǎn)生瓊膠酶的主要來(lái)源,海洋生態(tài)環(huán)境的多樣性造就了海洋細(xì)菌的多樣性,目前發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌產(chǎn)生的瓊膠酶在分子結(jié)構(gòu)、大小、底物特異性和催化活性等方面都有獨(dú)特的功能[1]。本研究擬從多種海藻和刺參中分離、篩選、鑒定瓊膠降解細(xì)菌,優(yōu)化高效產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件,為了解瓊膠酶降解菌多樣性、發(fā)現(xiàn)新型瓊膠酶打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 瓊膠降解菌的分離和篩選

將從青島各海邊采集的腐爛紫菜、海帶、江蘺和從煙臺(tái)東方海洋公司收集的刺參腸道分別放入無(wú)菌研缽中充分研磨勻漿,用無(wú)菌海水稀釋勻漿液,取合適稀釋度的勻漿液涂布于 2216E海水固體培養(yǎng)基上,于 28℃培養(yǎng)觀察一周。挑取周?chē)霈F(xiàn)明顯凹陷的菌落,在2216E海水平板劃線純化兩次,得到的菌株在平板培養(yǎng)48 h后用Lugols碘液染色觀察其菌落周?chē)a(chǎn)生水解透明圈的情況。取產(chǎn)生明顯透明圈的菌株保存于–80℃冰箱。

1.2 瓊膠酶活力的測(cè)定

1.2.1 粗酶液的制備

取細(xì)菌單菌落接入 2216E液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后,按5%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的100 mL2216E液體培養(yǎng)基內(nèi),于28℃、搖速120 r/min培養(yǎng)一定時(shí)間,測(cè)定OD540后,取10 mL培養(yǎng)液在4℃、6 000 r/min離心20 min,收集上清液用于細(xì)菌胞外酶酶活測(cè)定。收集細(xì)胞沉淀測(cè)定濕質(zhì)量后,懸浮于 10 mL PBS(pH7.4,0.2 mol),在冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞: 200 W破碎3次,每次破碎時(shí)間10 s,間隔時(shí)間10 s ,細(xì)胞破碎液經(jīng)4℃、12 000 r/min離心20 min,收集上清液用于胞內(nèi)酶酶活的測(cè)定[6]。另取10 mL細(xì)菌培養(yǎng)液直接超聲破碎、離心,上清用于總酶活的測(cè)定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 瓊膠酶活力測(cè)定

采用 DNS測(cè)定還原糖的方法測(cè)定瓊膠酶酶活[7]。用D-半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。1 mL粗酶液與1 mL 0.3%的瓊脂底物溶液(用pH 7.4,0.2 mol的 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制)混合,40℃反應(yīng) 30 min后,加入1.5 mL DNS,煮沸5 min,加入蒸餾水定容至25 mL,在520 nm處測(cè)定還原糖吸收值。在上述反應(yīng)條件下,每分鐘產(chǎn)生l g還原糖所需的酶量作為一個(gè)酶活力單位。相對(duì)酶活力為每mg細(xì)菌濕重產(chǎn)生的酶活力單位。

1.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.3.1 最適培養(yǎng)基的選擇

比較分離菌株在 2216E海水培養(yǎng)基,分離培養(yǎng)基[8],發(fā)酵培養(yǎng)基[9]的生長(zhǎng)情況。

分離培養(yǎng)基: 瓊脂 1.3 g,NaCl 2.5 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,NaNO30.2 g,K2HPO41.0 g,FeSO4·7H2O 0.002 g,CaCl20.02 g,蒸餾水 100 mL,pH 7.5;發(fā)酵培養(yǎng)基: 瓊脂 1.3 g,NaCl 2.5 g,蛋白胨 0.5 g,酵母膏 1 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,蒸餾水100 mL,pH 7.5。

取細(xì)菌單菌落分別接入上述液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后,按5%接種量轉(zhuǎn)接100 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基,在28℃、搖速120 r/min條件下培養(yǎng),在24、36、48、72 h測(cè)定菌懸液的 OD540、細(xì)菌質(zhì)量及相對(duì)酶活力,根據(jù)相對(duì)酶活力大小確定最適培養(yǎng)基及最適培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.2 最適培養(yǎng)條件的選擇

利用1.3.1得到的最適培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,在28℃、搖速120 r/min條件下,進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)溫度、初始pH和瓊膠底物濃度。設(shè)置的培養(yǎng)溫度為15℃、20℃、28℃、37℃,pH為5、7.5、9,培養(yǎng)基瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.3%、0.5%、1%。在上述培養(yǎng)條件下測(cè)定各菌株的相對(duì)酶活力。

1.4 菌株鑒定

按常規(guī)方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和形態(tài)觀察,用API ID-32E試劑條(生物-梅里埃,法國(guó))進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測(cè),根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)確定細(xì)菌的分類(lèi)地位;按文獻(xiàn)方法進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA序列擴(kuò)增和序列比對(duì)分析[10]。利用軟件Clustal X(V2.0)進(jìn)行序列完全比對(duì),比對(duì)參數(shù)中Output Files選項(xiàng)中選擇NEXUS format。利用Mrmodeltest3.7估計(jì)核酸最優(yōu)取代模型,應(yīng)用于BI的構(gòu)建。利用MrBayes3.1.2,采用GTR+I+G模型,構(gòu)建貝葉斯樹(shù)[11]。綜合生理生化、16SrDNA序列比對(duì)聚類(lèi)分析結(jié)果綜合鑒定細(xì)菌。

1.5 瓊膠酶基因的克隆和分析

根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì) PCR引物擴(kuò)增細(xì)菌瓊膠酶基因agaB[12],正向引物 agaB-for: 5'-ccacttagcactagagcccgtaa-3',反向引物agaB-rev: 5'-tgtacctagcagattgcactccc-3'。在25 μL的PCR反應(yīng)體系中含有: 10×PCR buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol)各 1 μL,引物(10 μmol)各 1 μL, Taq DNA 聚合酶(5U/UL)0.5μL,DNA 模板 1 μL。PCR 反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s,45℃復(fù)性45 s,72℃延伸3 min,30個(gè)循環(huán);72℃溫育10 min。用MEGA4軟件建樹(shù)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件分析各組數(shù)據(jù)的平均值、顯著性等。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選以及菌落形態(tài)觀察

利用 2216E海水固體培養(yǎng)基從腐爛藻體以及刺參腸道內(nèi)篩選到多株具有降解瓊膠能力的菌株,可觀察到在菌落處形成明顯的凹陷,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),菌落周?chē)霈F(xiàn)可辨的透明圈。用Lugols碘液覆蓋菌落周邊區(qū)域,被降解的瓊膠不能與碘著色而呈明顯的透明區(qū)(圖 1,A),未降解瓊膠與碘結(jié)合呈棕褐色(圖1,B)。根據(jù)培養(yǎng)48 h后菌落產(chǎn)生的透明圈半徑初步判斷酶活力大小,分別從紫菜、海帶、江蘺、刺參腸道內(nèi)篩選到 4株產(chǎn)瓊膠酶酶活力最高的菌株,編號(hào)分別為QJ、HD、JL和HS,其透明圈半徑(不包括菌落半徑)大小均在0.7～0.8 cm。

在2216E平板上,HD、JL和HS菌株生長(zhǎng)較快,24 h即可長(zhǎng)出半徑0.1～0.3 cm的菌落,可觀察到菌落周?chē)忻黠@的透明圈,48 h后菌落處瓊膠出現(xiàn)凹陷,一周后平板瓊膠完全分解、液化。QJ菌株在2216E的生長(zhǎng)較緩慢,培養(yǎng)36 h的菌落半徑約為0.1 cm,但可觀察到菌落周?chē)a(chǎn)生明顯凹陷或透明圈,培養(yǎng)過(guò)程中未出現(xiàn)平板液化現(xiàn)象。

圖1 用盧戈氏碘液染色的細(xì)菌平板Fig.1 Bacterial cultures stained with Lugol iodine

2.2 最佳產(chǎn)酶條件的確定

2.2.1 最適培養(yǎng)基的確定

將4株菌分別在液體的2216E海水培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng),測(cè)定 24、36、48和72 h的OD540值以及相對(duì)酶活力。結(jié)果如圖2所示,4株菌在3種培養(yǎng)基生長(zhǎng)36 h的OD540值最大(P＜0.05),相對(duì)酶活力最高 (P＜0.05);4株菌在2216E培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好,在36 h的相對(duì)酶活力在80 U/mg以上。結(jié)果還顯示,菌株QJ在3種培養(yǎng)基的OD540低于其他3株菌,在發(fā)酵培養(yǎng)基中基本不生長(zhǎng);在靜置培養(yǎng)時(shí),4株細(xì)菌易形成菌膜,在搖床培養(yǎng)時(shí)有絮狀出現(xiàn)。

結(jié)果表明,4株菌最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基為2216E海水培養(yǎng)基,產(chǎn)酶最適培養(yǎng)時(shí)間為36 h。

圖2 瓊膠降解菌在3種培養(yǎng)基的相對(duì)酶活和OD540Fig.2 The relative enzymatic activities and OD540values of the agarase-producing bacteria cultured in three different media

2.2.2 其他培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以 2216E液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,120 r/min搖速培養(yǎng)細(xì)菌 36 h,確定培養(yǎng)溫度、pH、瓊膠底物濃度對(duì)細(xì)菌產(chǎn)酶的影響。如圖 3所示,培養(yǎng)溫度為28℃時(shí),4株菌顯示最高相對(duì)酶活(P＜0.05)。培養(yǎng)基起始pH為7.5時(shí),4株菌的相對(duì)酶活最高;除JL和HD在 pH7.5的相對(duì)酶活與 pH5.0時(shí)的相比有顯著差異外(P＜0.05),其他無(wú)明顯差異(P＞0.05)。培養(yǎng)基瓊膠濃度為0.30%時(shí),4株菌的相對(duì)酶活最高,除HD、JL、HS在0.30%瓊膠的酶活與0.50%的酶活相比差異不顯著外,其他均呈顯著差異(P＜0.05)。

綜合上述結(jié)果,4株菌產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)條件:2216E液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,培養(yǎng)基起始pH7.5,瓊膠底物濃度0.30%,培養(yǎng)溫度28℃,120 r/min搖床,培養(yǎng)時(shí)間36 h。

圖3 細(xì)菌在不同溫度、pH、底物濃度培養(yǎng)36 h的相對(duì)酶活力Fig.3 The relative enzymatic activities under different temperature,pH and substrate concentrations for 36 h

2.3 細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)酶部位的確定

制備 4株細(xì)菌胞外酶和胞內(nèi)酶的粗酶液,測(cè)定酶活并比較大小。結(jié)果如圖4所示,在4株細(xì)菌的細(xì)胞外檢測(cè)到的相對(duì)酶活力顯著高于胞內(nèi)相對(duì)酶活力(P＜0.01),胞外酶活占總酶活的90%以上。

2.4 瓊膠降解菌菌株的鑒定

4株瓊膠降解菌均為G-,菌落光滑、圓形、白色或奶油色。電鏡下HD、JL和HS菌株的細(xì)菌形態(tài)為直或彎短桿狀,有周生纖毛;QJ為長(zhǎng)桿狀,無(wú)周生或極生鞭毛。16SrDNA基因序列相似性比較結(jié)果顯示,菌株HD、JL和HS與白色噬瓊膠菌最相似,相似性均達(dá)到98%,QJ與Simiduia sp.、糖噬胞菌屬和船蛆桿菌屬最相似,相似性分別為94%、94%、93%。HD、JL、QJ、HS的 16SrDNA基因序列登錄號(hào)為JX070038-JX070041。16SrDNA基因序列的聚類(lèi)分析顯示,HD、JL、HS與白色噬瓊膠菌屬聚為一類(lèi),QJ與糖噬胞菌屬、船蛆桿菌屬、假單胞菌屬、海微菌屬(Marinimicrobium sp.)等聚為一簇,但形成一個(gè)獨(dú)立的分支(圖5)。生理生化反應(yīng)指標(biāo)顯示,菌株HD、JL和HS的生理生化反應(yīng)指標(biāo)一致,與文獻(xiàn)描述的白色噬瓊膠菌的特征相近;菌株QJ與 Simiduia sp.、糖噬胞菌屬、船蛆桿菌屬的特征有不同(表1)。綜合生理生化特征和16SrDNA基因序列分析結(jié)果,將HD、JL和HS鑒定為白色噬瓊膠菌;菌株QJ的分類(lèi)地位待定。

2.5 瓊膠酶基因的克隆

從JL、HD和HS基因組DNA擴(kuò)增得到β-瓊膠酶基因(登錄號(hào)為 JX070035-JX070037),均含有一個(gè)2868bp的閱讀框,三者之間的相似性達(dá)到98%～99%,與白色噬瓊膠菌屬和弧菌屬菌株的 β-瓊膠酶蛋白質(zhì)序列相似性為 98%～99%,相關(guān)序列聚類(lèi)分析如圖 6所示。

3 討論

本研究利用瓊膠作為碳源,從青島海域的腐爛海帶、紫菜、江蘺和煙臺(tái)的養(yǎng)殖刺參中分離到多株瓊膠降解菌,經(jīng)過(guò)比較菌落降解瓊膠產(chǎn)生的凹陷直徑大小,得到 4株具有較高瓊膠降解能力的瓊膠降解菌并進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化。目前多數(shù)的研究以含有較高蛋白胨和酵母膏的發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)瓊膠降解菌,以獲得高酶量[9],本研究結(jié)果表明以寡營(yíng)養(yǎng)的 2216E培養(yǎng)基就能獲得較高的酶量,可以減少培養(yǎng)成本。

圖4 4株菌胞內(nèi)外酶活的比較Fig.4 Comparison of intracellular and extracellular enzymes activities in the 4 strains

圖5 瓊膠降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis diagram of the agarase-producing bacteria

圖6 瓊膠酶基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis diagram of the agarase genes

表1 4株瓊膠降解菌及相關(guān)菌株生理生化性狀Tab.1 Comparison of the physiological and biochemical characteristics between the agarase-producing bacteria and the other relative bacterial species

續(xù)表

細(xì)菌鑒定結(jié)果表明,菌株HD、JL和HS為白色噬瓊膠菌,與一些學(xué)者的研究結(jié)果一致[13-16]。已從白色噬瓊膠菌屬分離純化到胞外β-瓊膠酶,其降解產(chǎn)物有的為新瓊二糖[15,17]、有的為新瓊四糖、六糖組成的瓊膠寡糖[16,18];理化性質(zhì)也有所不同,如 Long等[18]發(fā)現(xiàn)一種新的β-瓊膠酶在較廣的 pH范圍內(nèi)保持較高的活性。本研究從HD、JL和HS擴(kuò)增得到β-瓊膠酶基因,這些酶的特性有待進(jìn)一步確定。

從紫菜分離得到的 QJ菌株的分類(lèi)地位與Simiduia sp.、糖噬胞菌屬、船蛆桿菌屬等的親緣關(guān)系較近,這些屬的細(xì)菌都具有分解復(fù)雜多糖的特性,如船蛆桿菌能分解纖維素[19],Simiduia agarivorans能降解瓊脂[20-21],糖噬胞菌屬能分解多種復(fù)雜多糖,如褐藻膠、幾丁質(zhì)、海帶多糖、淀粉、木聚糖等[21]。QJ菌株的生理生化特征與這些細(xì)菌有所不同,其分類(lèi)地位需要進(jìn)一步確定。

[1]Fu X T,Sang M K.Agarase: review of major sources,categories,purification method,enzyme characteristics and applications [J].Mar Drugs,2010,8: 200-218.

[2]Groleau D,Yaphe W.Enzymatic hydrolysis of agar:purification and characterization of beta neoagarotetraose hydrolase from Pseudomonas atlantica [J].Can J Microbiol,1977,23(6): 672-679.

[3]Morrice L M,Mclean M W,Williamson F B,et al.Beta-agarase Ⅰ and Ⅱ from Pseudomonas atlantic:purification and some properties [J].Eur J Biochem,1983,135(3): 553-558.

[4]Ma C,Lu X,Shi C,et al.Molecular cloning and characterization of a novel beta-agarase,AgaB,from marine Pseudoalteromonas sp.CY24 [J].J Biol Chem,2007,282: 3747-3754.

[5]Lu X Z,Chu Y,Wu Q Q,et al.Cloning,expression and characterization of a new agarase-encoding gene from marine Pseudoalteromonas sp.[J].Biotechnology Letters,2009,31(10): 1565-1570.

[6]Jean H E.The role of bacteria in the digestion of seaweed by the ablone Hallotls [J].Aquaculture,1997,155:377-386.

[7]Miller G L,Blum R,Glennon W E,et al.Measurement of carboxy methy Ieellulase activity [J].Analytical Biochmistry,1960,(2): 127-132.

[8]陳惠源,蔡俊鵬,劉江濤.海洋細(xì)菌產(chǎn)瓊膠酶的條件優(yōu)化 [J].現(xiàn)代食品科技,2005,21(3): 48-50.

[9]王曉燕,桑衛(wèi)國(guó),章宗銘.腐爛紫菜中瓊膠酶高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定 [J].食品科技,2009,34(7): 2-5.

[10]Woese C W R,Gutell R,Gupta R,et al.Detailed analysis of the higher-order structure of 16S-like ribosomal ribonucleic acids [J].Microbiology Reviews,1983,47(3):621-669.

[11]Ronquist F,Teslenko M,et al.MrBayes 3.2: efficient bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space [J].Systematic Biology,2012,61(3):539-542.

[12]Sugano Y,Terada I,Arita M,et al.Purification and charactetrization of a new agarase from a marine bacterium,Vibrio sp.strain JT0107 [J].Appl Environ Microbiol,1993,59(5): 1549-1554.

[13]杜宗軍.海洋瓊膠降解細(xì)菌的多樣性研究與Agarivorans albus QM38 β-瓊膠酶基因的克隆與表達(dá)[D].青島: 中國(guó)海洋大學(xué),2007.

[14]Kurahashi M,Yokota A.Agarivorans albusgen.nov.,sp.nov.,a gamma-proteobacterium isolated from marine animals [J].Int J Syst Evol Microbiol,2004,54:693-697.

[15]Fu X T,Lin H,Kim S M.Purification and characterization of a novel β-agarase,AgaA34,from Agarivorans albus YKW-34 [J].Appl Microbiol Biotechnol,2008,78:265-273.

[16]Du Z J,Wang J,Yang L J,et al.Identification of a marine agarolytic bacterium Agarivorans albus QM38 and cloning and sequencing its beta-agarase genes [J].Acta Oceanol Sin,2011,30(1): 118-124.

[17]Lee D G,Park G T,Kim N Y,et al.Cloning,expression,and characterization of a glycoside hydrolase family 50 β-agarase from a marine Agarivorans isolate[J].Biotechnol Lett,2006,28: 1925-1932.

[18]Long M X,Yu Z N,Xu X.A Novel β-Agarase with high pH stability from marine Agarivorans sp.LQ48 [J].Mar Biotechnol,2010,12: 62-69.

[19]Daniel L D,Wendy M,Noelle M T,et al.Teredinibacter turnerae gen.nov.,sp.nov.,a dinitrogen-fixing,cellulolytic,endosymbiotic c-proteobacterium isolated from the gills of wood-boring molluscs (Bivalvia:Teredinidae)[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2002,52: 2261-2269.

[20]Wung Y S,Liu T Y,Lin S Y,et al.Simiduia agarivorans gen.nov.,sp.nov.,a marine,agarolytic bacterium isolated from shallow coastal water from Keelung,Taiwan [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2008,58: 895-900.

[21]Nathan A E,Jose M G,Michael B H,et al.Saccharophagus degradans gen.nov.,sp.nov.,a versatile marine degrader of complex Polysaccharides [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2005,55: 1545-1549.