自然寄生松墨天牛蟲生真菌的分離、鑒定及其生物學(xué)特性的研究

蒲順昌，劉玉軍，葛永斌，燕傲蕾

（1.亳州師范高等專科學(xué)校，安徽 亳州236800；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 省微生物防治重點實驗室，安徽 合肥230036）

松墨天牛Monochamus alternatus是我國松樹的重要蛀干害蟲，也是松樹病害松材線蟲病Bursaphelenchus xylophilus的主要媒介昆蟲。在松材線蟲擴(kuò)散和侵染過程中，松墨天牛起著攜帶、傳播和協(xié)助病原侵入寄主的關(guān)鍵性作用［1－2］。松材線蟲病是一種特大毀滅性森林病害，對我國松林資源、自然景觀和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的破壞。因松材線蟲發(fā)生在松樹木質(zhì)部，防治難度較大，故防治松墨天牛是有效控制松材線蟲病傳播的重要手段［3］。由于松墨天牛幼蟲生活隱蔽、成蟲羽化期長，化學(xué)防治極其困難，并且會造成污染環(huán)境［4］。真菌殺蟲劑具有不污染環(huán)境，并能有效地在林間宿存和流行的特點，生物防治專家在利用真菌防治松墨天牛方面做了大量的工作，認(rèn)為球孢白僵菌Beauveria bassiana是松墨天牛生物防治最具潛力的病原之一［5－7］。為探討使用白僵菌防治松墨天牛的有效途徑，有必要對分離自同一區(qū)域、同一寄主，但不同時間的8株球孢白僵菌菌株進(jìn)行生物學(xué)特性的研究，旨在為篩選出對松墨天牛成蟲具有高毒力生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試8株球孢白僵菌菌株全部分離自安徽黃山松林中野外感病死亡的松墨天牛成蟲。經(jīng)過室內(nèi)分離及形態(tài)鑒定，均為球孢白僵菌菌株，菌株均保存于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點實驗室。

1.2 培養(yǎng)基［8］

PPDA培養(yǎng)基（成分為：馬鈴薯200g，葡萄糖30 g，瓊脂20g，酵母10g，水1 000ml）。SDAY培養(yǎng)基（成分為：葡萄糖40g，瓊脂20g，酵母10g，蛋白胨10g，水1 000ml）。

1.3 標(biāo)本分離與培養(yǎng)［9］

采用松墨天牛僵蟲體表分生孢子劃線分離法進(jìn)行分離。為防止其它雜菌污染，使用加入氨芐青霉素（0.4g），鹽酸鏈霉素（1g），水（1 000mL）的SDAY培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 標(biāo)本鑒定

在標(biāo)本室內(nèi)觀察分離純化的菌株，并記錄菌落的色澤、形態(tài)、生長速度等培養(yǎng)性狀。挑取少許菌株初產(chǎn)孢的培養(yǎng)物，用玻片熏蒸固定法制成臨時載玻片，在數(shù)碼顯微鏡下觀察各菌株的孢子形狀與大小。

1.5 不同菌株生物學(xué)特性的研究［10］

1.5.1 菌落生長性狀觀察

等量點接供試菌株的新鮮菌落到PPDA平板，恒溫25±1℃培養(yǎng)，封口膜封口，每菌株3個重復(fù)。每天觀察菌落的生長、色澤、形態(tài)和產(chǎn)孢等情況，在培養(yǎng)的第14d采用十字交叉法分別測量各菌株的菌落生長直徑。

1.5.2 產(chǎn)孢量測定

將培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d的菌落，用直徑為13mm的打孔器從每一菌落的中心點至邊緣距離的1/2處打孔截取小菌塊，每菌株3個重復(fù)。然后將小菌塊加入0.05%吐溫80（w/v）水溶液，經(jīng)磁力攪拌器攪拌10min，獲孢子懸浮液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。

1.5.3 孢子萌發(fā)率測定

將孢懸液用微量移液器吸取15μL滴在2%瓊脂的載玻片上。做3個不同重復(fù)，置于25±1℃的條件下培養(yǎng)。鏡檢稀釋至每個視野有20～30個孢子，24h后在顯微鏡下取10個不同視野（不少于100個孢子）鏡檢萌發(fā)率。

根據(jù)觀察數(shù)據(jù)計算孢子萌發(fā)率，即：孢子萌發(fā)率＝（發(fā)芽孢子數(shù)）/（總孢子數(shù)）×100%。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果經(jīng)方差分析后進(jìn)行Duncan's多重比較檢驗各處理間的差異顯著性（P＝0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)及分子鑒定

經(jīng)室內(nèi)分離培養(yǎng)，其形態(tài)特征如下［11］：菌株在PPDA上外觀似氈狀、絨毛狀或粉狀，色澤白色，基質(zhì)色澤黃色，無孢梗束，無明顯氣味，菌絲光滑。菌落生長較快，14d后，直徑達(dá)到3.2～4.9cm。分生孢子梗多著生于營養(yǎng)菌絲上，分生孢子濃密簇生分生孢子梗上，球形至瓶形，頸部軸上具明顯的“之”字形彎曲，在分生孢子?；蚓z上聚成緊密的孢子頭。分生孢子球形或近球形，大小為2.1～2.9μm×1.6～2.3 μm。從菌落形態(tài)和分生孢子的形態(tài)特征將其全部鑒定為球孢白僵菌。通過ITS－DGGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)，這些菌株在條帶上無明顯差異，并未出現(xiàn)像Pu等［12］通過PCR－DGGE電泳技術(shù)研究白僵菌基因分型中出現(xiàn)顯著差異條帶的假球孢白僵菌［13］。因此，根據(jù)形態(tài)特征和分子數(shù)據(jù)，將這8株來自松墨天牛蟲的病原真菌鑒定為狹義球孢白僵菌。

2.2 生物學(xué)特性研究

菌株營養(yǎng)生長快慢是反映菌株優(yōu)良性狀指標(biāo)之一。對8株菌株進(jìn)行營養(yǎng)生長的比較測定，獲得菌落平均生長直徑及產(chǎn)孢量值（表1）。由表1可知，8株球孢白僵菌菌株之間營養(yǎng)生長有明顯差異。以Bb660生長最快，14d時菌落直徑為48.26mm，顯著高于其他7個菌株。

同時，菌株Bb660的產(chǎn)孢量明顯優(yōu)于其他各菌株，其中產(chǎn)孢量最高的菌株Bb660比最低的Bb408要高2.3倍，產(chǎn)孢量最小的菌株Bb408僅為0.53×108個/mL。產(chǎn)孢量是菌株的重要評價指標(biāo)，同時也與侵染能力及擴(kuò)散范圍具有很大的相關(guān)性。

此外，各菌株間24h孢子萌發(fā)率均超過80%，說明8株菌株均具有較強(qiáng)的萌發(fā)能力，但也存在著顯著性差異。Bb660孢子平均萌發(fā)率最高，24h的孢子平均萌發(fā)率分別為97.48%，而孢子平均萌發(fā)率最低的Bb398也達(dá)到了80.67%（表1）。

表1 球孢白僵菌不同菌株的生長、產(chǎn)孢及萌發(fā)情況

3 討論

應(yīng)用蟲生真菌防治松褐天牛時，天牛成蟲由于與釋放菌株接觸機(jī)會多，因而是防治的關(guān)鍵蟲期。蟲生真菌由于受到野外高溫、干旱和紫外線等多種環(huán)境因子的影響，對其林間應(yīng)用效果產(chǎn)生了重要的制約。因此，對室內(nèi)篩選的菌株，還需結(jié)合菌株的其他特性，如抗高溫能力、抗旱能力和抗紫外線能力等指標(biāo)進(jìn)行綜合評價。

本試驗僅對8株球孢白僵菌菌株進(jìn)行了生物學(xué)特性的研究，下一步還需對松墨天牛卵、幼蟲及成蟲的致病能力進(jìn)行研究，以便篩選出高毒力菌株，對松墨天牛各個蟲期采取有針對性的防治措施提供科學(xué)依據(jù)。目前，在林間噴霧、噴粉法防治森林害蟲中，真菌孢子很難接觸到樹干內(nèi)的天牛幼蟲，優(yōu)良菌株很難完全發(fā)揮效用，這是蛀干害蟲防治中的難題。針對天牛類蛀干害蟲而開發(fā)的長持效期新型菌劑無紡布菌條已經(jīng)用于多種天牛類蛀干害蟲的防治［14－16］。此外，利用引誘劑防治松墨天牛已成為近年來研究的熱點［17－19］。因此，可以利用引誘劑結(jié)合無紡布菌條聯(lián)合防治松墨天牛，以提高球孢白僵菌對該類天牛的防治效果。

［1］楊寶君，徐福元.松材線蟲病的潛伏侵染及松墨天牛傳播途徑［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2002，15（3）：251－255.

［2］崔永三，劉云鵬，宋玉雙，等.應(yīng)用天敵昆蟲防治松墨天牛試點試驗［J］.中國森林病蟲，2011，30（4）：31－33.

［3］王四寶，黃勇平，張心團(tuán)，等.松褐天牛成蟲高毒力病原真菌篩選及林間感染試驗［J］.中國森林病蟲，2004，23（6）：13－16.

［4］李成德.中國森林昆蟲［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2005.

［5］Shimazu M，Sato H.Effects of larval age on mortality ofMonochamus alternatusHope（Coleoptera：Cerambycidae）after application of non－woven fabric strips withBeauveria bassiana［J］.Applied Entomology and Zoology，2003，38（1）：1－5.

［6］周性恒，朱洪兵.南京地區(qū)松墨天牛病原真菌的調(diào)查研究［A］.中國松材線蟲病的流行與治理［M］.北京：中國林業(yè)出版社，1995.

［7］張立欽，劉軍，吳鴻.松墨天牛優(yōu)良白僵菌菌株篩選［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，24（2）：33－37.

［8］蒲蟄龍，李增智.昆蟲真菌學(xué)［M］.合肥：安徽科技出版社，1996.

［9］陳名君，黃勃，王蒙，等.瑯琊山蟲生真菌物種多樣性和時間分布［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2007，18（9）：2075－2079.

［10］劉玉軍，張龍娃，何亞瓊，等.櫟旋木柄天牛高毒力球孢白僵菌菌株的篩選［J］.昆蟲學(xué)報，2008，51（2）：143－149.

［11］陳名君，劉玉軍，周娜，等.皇甫山蟲生真菌物種多樣性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，36（4）：564－567.

［12］Shun－chang Pu，Ming－jun Chen，Zhong－you Ma，et al.Genotyping isolates of the entomopathogenic fungusBeauveria bassiana sensu latoby multi－locus polymerase chain reaction－denaturing gradient gel electrophoresis（PCR－DGGE）analysis［J］.African Journal of Biotechnology，2010，9（23）：4290－4294.

［13］Rehner SA，Posada F，Buckley EP.Phylogenetic origins of African and neotropicalBeauveria bassiana s.l.pathogens of the coffee berry borer，Hypothenemus hampei［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2006，（93）：11－21.

［14］張波，白楊，島津光明，等.無紡布防治光肩星天牛成蟲的初步研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，1999，14（1）：68－72.

［15］Tsutsumi T，Yamanaka M.In fection by entomogenous fungus，Beauveria brongniartii（Sacc.）Petch GSES，of adults of yellow spotted longicorn beetle，Psacothea hilarisby dispersing conidia from non－woven fabric sheet containing fungus［J］.Japanese Journal of Applied Entomology and Zoology，1997，41（1）：45－49.

［16］Hajek A E，Huang B，Dubois T，et al.Field studies of control ofAnoplophora glabripennis（Coleoptera：Cerambycidae）using fiber bands containing the entomopathogenic fungiMetarhizium anisopliaeandBeau veria brongniartii［J］.Biocontrol Science and Technology，2006，16（4）：329－343.

［17］王濱，樊美珍，李增智.白僵菌無紡布結(jié)合引誘劑防治鞘翅目林業(yè)害蟲研究初報［J］.中國生物防治，2003，19（2）：91－92.

［18］Anbutsu H，Togashi K.Oviposition deterrent by female reproductive gland secretion in Japanese pines awyer，Monochamus alternatus［J］.Journal of Chemical Ecology，2001，27（6）：1151－1161.

［19］王四寶，劉云鵬，樊美珍，等.不同誘捕技術(shù)對松褐天牛的誘捕效果［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2005，16（3）：505－508.