CASP3基因多態(tài)性與川崎病及其冠狀動脈損害易感性的關(guān)系

陳 偉，張宏艷，林書祥

(1天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070;2天津市兒童醫(yī)院)

川崎病是一種免疫介導(dǎo)的兒童急性血管炎綜合征，主要侵襲全身中型肌動脈，其中以冠狀動脈受累最為嚴重，它可致冠狀動脈擴張、冠狀動脈瘤、狹窄甚至閉鎖，已經(jīng)成為許多國家兒童獲得性心臟病的最常見原因［1］，其發(fā)病率近年來呈上升趨勢［2，3］。國外研究表明，川崎病發(fā)病具有種族差異性和遺傳易感性［3，4］。編碼半胱天冬蛋白酶 3(Caspase-3)基因CASP3與川崎病易感性的相關(guān)性研究成為熱點課題［5～8］，國內(nèi)目前尚未見報道。本研究通過采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對川崎病患兒及對照組兒童外周血CASP3 rs113420705位點基因多態(tài)性進行分析，旨在探討CASP3基因多態(tài)性在中國漢族兒童中與川崎病及其冠狀動脈損害(CAL)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 川崎病組:2010年10月～2012年4月在天津市兒童醫(yī)院就診的川崎病患兒40例，均符合日本厚生省川崎病研究課題組第5版修訂川崎病診斷標準［2］，年齡2 個月 ～8歲(2．10 ±1．83)歲，男26例，女14例。受試者按冠狀動脈損害標準［9］分為冠狀動脈損害組(17例)和無損害組(23例)。對照組:天津市兒童醫(yī)院健康體檢兒童30例，年齡(2．32±1．75)歲，男18例，女12例，除外感染性疾病、免疫系統(tǒng)疾病、川崎病等疾病家族史。所有入組成員為漢族，籍貫為天津、河北及山東，在性別、年齡等方面無顯著性差異(P均＞0．05)，具有可比性。本研究采取標本時獲得所有患兒監(jiān)護人的知情同意，并獲得了天津市兒童醫(yī)院倫理委員會的批準。

1．2 方法

1．2．1 CASP3 rs113420705位點基因多態(tài)性檢測收取受試者(川崎病組為急性期清晨空腹采取)外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，－80℃冷凍保存。用DNA試劑盒(Promega公司)提取外周血基因組DNA，于－20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴增:根據(jù)NCBI公布rs113420705核苷酸序列用GENE RUNNER軟件設(shè)計引物:上游引物5'-CGGAAGCAGTGCAGACGC-3'，下游引物 5'-CACTCCGCCTTCCAGACC-3'，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為50μL，含基因組DNA 4μL，MasterMix 22μL，ddH2O 22 μL，上下游引物各 1 μL。采用美國ABI公司2720型PCR擴增儀，反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 10 min，變性94℃ 30 s，退火64℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，變性、退火、延伸共30個循環(huán)，終末延伸72℃ 5 min。取5μL PCR產(chǎn)物，2．0%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下鑒定產(chǎn)物。取182 bp處擴增條帶陽性標本的PCR產(chǎn)物30μL，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。應(yīng)用Chromas軟件分析所獲測序結(jié)果。利用NCBI網(wǎng)站在線blast對所獲序列進行對比分析。

1．2．2 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料以例(%)表示，組間比較及組間人群基因分布Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗采用χ2檢驗，檢驗水準雙側(cè)α=0．05。各組間CASP3 rs113420705位點等位基因型頻率、基因型頻率及各基因型的關(guān)聯(lián)強度采用比值比(OR)表示，采用95%置信區(qū)間(CI)。

2 結(jié)果

2．1 PCR擴增結(jié)果 PCR產(chǎn)物電泳目的條帶為182 bp，以50 bp Marker為核酸分子量參照標準，擴增產(chǎn)物目標條帶在150～200 bp。見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

2．2 CASP3 rs113420705基因型分布 參照NCBI網(wǎng)站SNP rs1801274，利用該網(wǎng)站在線blast對所獲序列進行對比分析發(fā)現(xiàn)，所有研究對象檢測到SNP rs113420705，基因型為 GG、GA及 AA 3種，見插頁Ⅱ圖2。其中病例組GG基因型12例，GA基因型19例，AA基因型9例;對照組GG基因型19例，GA基因型9例，AA基因型2例。川崎病組和對照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P均 ＞0．05)，表明各基因型頻率已達遺傳平衡，具有良好的群體代表性。

2．3 CASP3 rs113420705位點測序結(jié)果分析

2．3．1 川崎病組與對照組等位基因頻率及基因型頻率的分布 川崎病組A等位基因頻率為37(46．3%)，對照組為13(21．7%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9．03，P ＜ 0．05;OR=3．11，95%CI:1．46 ～6．62)。A等位基因的OR值＞1，故A等位基因使川崎病發(fā)生的危險度增加。川崎病組AA基因型頻率為9(22．5%)，GA 基因型為 19(47．5%)，GG 基因型為 12(30．0%)，對照組分別為 2(6．7%)、9(30%)、19(63．3%)，基因型分布在兩組間差異顯著(χ2=7．72，P ＜0．05)。攜帶 A 等位基因的 AA、GA 基因型的OR值均＞1(2．11、4．06)，表明攜帶A等位基因的AA、GA基因型使川崎病發(fā)生的危險度增加。

2．3．2 冠狀動脈損害組和無損害組等位基因及基因型分布 冠狀動脈損害組A等位基因頻率為37(46．3%)，冠狀動脈無損害組A等位基因頻率為13(21．7%)，A等位基因頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2．21，P ＞0．05，OR=1．97，95%CI:0．80～4．84)，而A等位基因的 OR值 ＞1，可見 A等位基因在一定程度上是川崎病患者冠狀動脈損害發(fā)生的危險因素。冠狀動脈損害組AA、GA、GG基因型頻率分別為 6(35．3%)、7(41．2%)、4(23．5%)，冠狀動脈無損害組分別為 3(13．0%)、12(52．2%)、8(34．8%)，攜帶A等位基因的AA、GA基因型頻率在兩組間無顯著差異 (χ2=0．59，P ＞0．05)。其中AA 基因型 OR=3．64，95%CI:0．76 ～17．46;GA 基因型 OR=0．64，95%CI:0．18 ～2．28?？梢姅y帶 A等位基因的基因型在一定程度上使川崎病發(fā)生冠狀動脈損害發(fā)生的危險因素增加。

3 討論

川崎病作為一種自身免疫性血管炎，其發(fā)病機制仍尚不清楚。一個可能原因為自身免疫降低，多見于感染侵襲后細胞凋亡過程發(fā)展有缺陷的兒童［10］。因此，通過鑒定與細胞凋亡機制相關(guān)的遺傳因素，將大大促進明確川崎病的病因。細胞凋亡是機體正常細胞在基因調(diào)控下的程序性死亡。T細胞異常活化是川崎病免疫損傷的關(guān)鍵步驟，在川崎病急性期外周血活化 T 細胞異常增高是由凋亡延遲所致［10，11］，而Caspase-3在T細胞凋亡中的作用至關(guān)重要［12］。

本研究應(yīng)用PCR和直接測序方法，檢測了40例川崎病患兒和30例健康兒童CASP3基因rs113420705，顯示CASP3基因rs113420705突變位點為3種基因型 GG、GA、AA，突變基因型分別為GA、AA。本研究結(jié)果顯示，CASP3基因rs113420705位點A等位基因可以導(dǎo)致川崎病發(fā)生的危險度增加(OR=3．11)。本組40例川崎病患兒中28例含有A等位基因，30例健康兒童中僅11例含有A等位基因，A等位基因頻率在川崎病組與對照組間比較具有顯著差異，含有A等位基因的兒童易發(fā)生川崎病，與Onouchi等［6］在日本人群和歐裔美國人群中得出的結(jié)論一致。

rs113420705位點位于CASP3基因5'非編碼區(qū)區(qū)，其與周圍堿基構(gòu)成的GGAA序列類似于轉(zhuǎn)錄因子—活化T細胞核因子(NFAT)的結(jié)合位點，它能開啟IL-2和其他細胞因子的轉(zhuǎn)錄。CASP3基因rs113420705位點為G等位基因時，其與周圍區(qū)域可以與NFAT結(jié)合，并作為T細胞受體信號激活T細胞的增強因素，CASP3表達上調(diào)，而在川崎病患兒中，該位點 G變?yōu)?A，其增強作用減弱，影響NFAT的結(jié)合，CASP3基因的表達明顯下降，使T細胞的凋亡受限，活化T細胞相應(yīng)增多，啟動了川崎病的發(fā)?。?］。當(dāng)CASP3表達下降時，NFATc2裂解減少［13］，致使多種炎性因子增加，也促進了川崎病的發(fā)生。這些遺傳變異又導(dǎo)致了炎性反應(yīng)過程中T細胞增殖增加及凋亡下降，在川崎病急性期、亞急性期，外周血活化T細胞異常增高［14］，又為川崎病的發(fā)生提供了條件。

本研究還顯示，CASP3基因rs113420705位點A等位基因?qū)е麓ㄆ椴“l(fā)生冠狀動脈損害的危險度增加(OR=1．97)，然而兩組差異并不顯著(χ2=2．21，P ＞0．05)，與 Onouchi等［6］在日本人群和歐裔美國人群中所得結(jié)論一致。

此外，Kuo等［8］在臺灣人群中發(fā)現(xiàn)，CASP3基因rs113420705位點為A等位基因的川崎病患兒易發(fā)生冠狀動脈瘤。本研究中發(fā)生冠狀動脈瘤者例數(shù)偏少，未能進行相關(guān)性驗證。Onouchi等研究顯示，A等位基因頻率在靜脈用人丙種免疫球蛋白(IVIG)不敏感患者中顯著增高［7］。本研究中所有患兒對IVIG敏感，未能進行CASP3基因與IVIG敏感性的相關(guān)比較，有待增加樣本量后進一步研究。

總之，川崎病是一種多原因引起的免疫性疾病，研究表明其與基因多態(tài)性相關(guān)，然至目前為止，并未形成定論。本研究表明，CASP3基因多態(tài)性與中國漢族兒童川崎病易感性相關(guān)，與冠狀動脈損害相關(guān)性并不明顯，仍有待于研究者在樣本量、人群等方面進行一步的綜合分析。

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