空瓶刺激心理應(yīng)激法建立大鼠血管內(nèi)皮損傷模型的評(píng)價(jià)

梁 斌，黎 靜，楊曉梅，謝 露

(廣西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，南寧530021)

血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)在維持血管正常功能方面發(fā)揮重要作用，它不僅是血液與組織液之間的屏障，而且可分泌多種活性物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)血管壁張力以及血管平滑肌的增殖，如內(nèi)皮素-1(ET-1)可以使血管強(qiáng)烈收縮及促進(jìn)細(xì)胞分裂，前列環(huán)素(PGI2)和一氧化氮(NO)使血管舒張等［1］。VEC受損或功能障礙是血管疾病發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要因素，與心血管疾病臨床危險(xiǎn)事件的發(fā)生密切相關(guān)［2］。在VEC損傷因素中，除高血壓、高血糖、高同型半胱氨酸、血脂紊亂、炎癥刺激外，心理應(yīng)激也是一個(gè)不容忽視的危險(xiǎn)因素。各式各樣的心理應(yīng)激刺激，如與情緒有關(guān)的焦慮、抑郁，與環(huán)境有關(guān)的空氣污染、噪聲，與行為有關(guān)的工作、生活壓力等，都可構(gòu)成各自獨(dú)立的心血管系統(tǒng)危險(xiǎn)因素［3］。心理應(yīng)激時(shí)交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，機(jī)體釋放腎上腺素(Adr)、皮質(zhì)醇(COR)、ET、血栓素B2(TXB2)及Adr的代謝產(chǎn)物如過(guò)氧化氫(H2O2)、甲醛(FA)、甲胺(MA)等物質(zhì)增多，或引起血管舒縮因子失調(diào)，或直接損害VEC，進(jìn)而引起血管病變［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，憤怒心理刺激模型可以損傷VEC，改變其形態(tài)并影響其功能。2011年5月1～22日，我們擬制作空瓶刺激心理應(yīng)激模型大鼠，通過(guò)觀察其行為學(xué)改變，檢測(cè)應(yīng)激激素及其代謝產(chǎn)物、VEC活性物及其超微結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行評(píng)價(jià)，為心理應(yīng)激與VEC損傷關(guān)系的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康成年雄性SD大鼠，10～15周齡，體質(zhì)量200～250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為 SCXK桂2009-0002。實(shí)驗(yàn)設(shè)備:臺(tái)式低速離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，iMARK型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Rad公司)，紫外光—可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器公司)，自動(dòng)恒溫水浴箱(南京環(huán)科試驗(yàn)設(shè)備有限公司)，-80℃低溫冰箱(日本三洋)，H-7650透射式電子顯微鏡(日本日立公司產(chǎn)品)，自制曠場(chǎng)箱，LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津產(chǎn)品)，SUPEL COSILTM LC-PAH色譜分離柱(日本島津產(chǎn)品)，超純水機(jī)(Mllipoer)，旋渦混勻器(德國(guó)IKA)，進(jìn)樣針(Hmailton)。試劑:Adr試劑盒(武漢華美生物公司)，ET試劑盒(北方放射免疫生物技術(shù)公司)，6-酮-前列環(huán)素 F1α(6-Keto-PGF1α)試劑盒(北方放射免疫生物技術(shù)公司)，TXB2試劑盒(北方放射免疫生物技術(shù)公司);COR試劑盒(北方生物技術(shù)研究所)，NO試劑盒(cayman chemical company)，過(guò)氧化氫(H2O2)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物有限公司產(chǎn)品);氨芐西林(Sigma產(chǎn)品);分析純?nèi)纫宜?TCA);MA(Sigma產(chǎn)品)，丹磺酰氯(Sigma產(chǎn)品)，37%FA水溶液(Sigma產(chǎn)品)，乙腈(美國(guó)Tedia產(chǎn)品)，甲醇(美國(guó)天地產(chǎn)品)，Milli2Q超純水，生理鹽水(湖南金健藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1．2 方法

1．2．1 分組與造模 將16只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組各8只，兩組第1周每天早晚9點(diǎn)定時(shí)喂水10 min;第8～21天，對(duì)照組(群居飼養(yǎng))早晚9點(diǎn)依然定時(shí)飲水10 min，模型組(孤獨(dú)飼養(yǎng))早晚9點(diǎn)按隨機(jī)表給予空瓶刺激或喂水10 min，兩組均按體質(zhì)量腹腔注射生理鹽水(200 g/mL)2次/d。

1．2．2 大鼠行為學(xué)觀察 采用自制曠場(chǎng)箱觀察大鼠行為學(xué)變化。曠場(chǎng)箱為高50 cm，長(zhǎng)、寬均為100 cm;其周壁、底面為黑色，底面用黃線劃分為面積相等的25格(20 cm ×20 cm)。將大鼠置于曠場(chǎng)箱底面的中心方格內(nèi)并開(kāi)始計(jì)時(shí)，采用單盲法觀察并記錄大鼠在3 min內(nèi)的行為。動(dòng)物穿越底面的格數(shù)(四爪均進(jìn)入的方格)記錄為水平活動(dòng)得分，跨越一格計(jì)1分;后肢直立次數(shù)(兩個(gè)前爪騰空或攀附箱壁)為垂直活動(dòng)得分，直立1次計(jì)1分。水平得分與垂直得分之和為總分。

1．2．3 血漿相關(guān)因子檢測(cè) 取各組大鼠血漿，用ELISA法檢測(cè) Adr，放射免疫法檢測(cè) ET、6-Keto-PGF1α、TXB2、COR，硝酸還原酶法檢測(cè) NO，化學(xué)比色法檢測(cè)H2O2，高效液相色譜法測(cè)MA、FA。

1．2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果以±s表示，組間差異比較采用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較 模型組垂直得分(11．33 ±4．97)分、水平得分(57．43 ±7．64)分、總分(68．77±10．94)分，對(duì)照分別為(5．83±1．47)、(42．50 ±8．41)、(48．33 ± 9．58)分;兩組比較，P 均 ＜0．05。

2．2 兩組大鼠血漿COR、Adr水平比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠血漿COR、Adr比較(n=8±s)

表1 兩組大鼠血漿COR、Adr比較(n=8±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0．05

組別 COR(ng/mL) Adr(pg/mL)模型組 21．47 ±3．65* 9．37 ±1．69*對(duì)照組14．67 ±2．98 2．73 ±1．34

2．3 兩組大鼠血漿6-Keto-PGF1α、TXB2水平比較見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠血漿6-Keto-PGF1α、TXB2水平比較(n=8，± s)

表2 兩組大鼠血漿6-Keto-PGF1α、TXB2水平比較(n=8，± s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0．05

組別6-Keto-PGF1α(pg/mL)TXB2(pg/mL)6-Keto-PGF1α/TXB2模型組 53．19 ±11．23* 515．07 ±68．66 0．10 ±0．02*對(duì)照組95．41 ±30．38 472．61 ±48．73 0．19 ±0．07

2．4 兩組大鼠血漿NO、ET水平比較 見(jiàn)表3。

表3 兩組大鼠血漿NO、ET水平比較(n=8ˉ±s)

表3 兩組大鼠血漿NO、ET水平比較(n=8ˉ±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0．05

組別 NO(mmol/mL) ET(pg/mL)NO/ET模型組 19．13 ±2．95* 28．89 ±2．53* 0．66 ±0．09*對(duì)照組25．00 ±4．04 24．73 ±6．35 1．02 ±0．18

2．5 兩組大鼠血漿 MA、FA、H2O2水平比較 見(jiàn)表4。

表4 兩組大鼠血漿MA、FA、H 2O2水平比較(n=8，±s)

表4 兩組大鼠血漿MA、FA、H 2O2水平比較(n=8，±s)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0．05

組別 MA(ng/mL) FA(ng/mL) H2O2(mmol/L)模型組 37．35 ±10．14* 7．34 ±2．37* 57．20 ±10．28*對(duì)照組22．78 ± 4．24 4．72 ±1．20 23．92 ± 8．04

2．6 兩組大鼠主動(dòng)脈VEC透射電鏡結(jié)果比較 對(duì)照組VEC線粒體結(jié)構(gòu)完整，嵴清晰、排列緊密;模型組VEC線粒體腫脹、內(nèi)有空泡，嵴結(jié)構(gòu)疏松。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠主動(dòng)脈VEC透射電鏡結(jié)果(×5 000)

3 討論

應(yīng)激是指施加于個(gè)體的、引起個(gè)體發(fā)生反應(yīng)的軀體或心理的壓力，是個(gè)體在覺(jué)察需求與滿足需求的能力不平衡時(shí)傾向于通過(guò)整體心理和生理反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)的多因素作用的適應(yīng)過(guò)程［5］。心理應(yīng)激作為應(yīng)激的一個(gè)重要部分，它與疾病之間亦有著緊密聯(lián)系，無(wú)論是急性或慢性心理應(yīng)激都顯著影響疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后，如腫瘤、高血壓、中風(fēng)等［6］。因此，成功構(gòu)建一個(gè)心理應(yīng)激動(dòng)物模型，用以研究人們對(duì)應(yīng)激概念的認(rèn)識(shí)及對(duì)應(yīng)激相關(guān)性疾病的研究尤為重要。

應(yīng)激的反應(yīng)主要有情緒反應(yīng)、行為反應(yīng)、認(rèn)知反應(yīng)和心理防御反應(yīng)等。焦慮、憤怒、恐懼及抑郁是應(yīng)激環(huán)境下的主要情緒反應(yīng)，由于應(yīng)激源、情境因素和機(jī)體特點(diǎn)的不同而不同。應(yīng)激下的行為反應(yīng)與情緒反應(yīng)一樣，因應(yīng)激源及環(huán)境因素等的不同而不同。攻擊是個(gè)體受到挫折之后常見(jiàn)的反應(yīng)［7］。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是研究大鼠在新環(huán)境中的探究行為及情緒的經(jīng)典方法，可有效評(píng)價(jià)動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的興奮性、適應(yīng)性、探究、緊張、記憶等多種行為［8］，可用來(lái)測(cè)試動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑郁狀態(tài)［9］。實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物的水平得分反映動(dòng)物的興奮性，垂直得分則主要反映動(dòng)物對(duì)周圍環(huán)境的不確定性和探究趨勢(shì)［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠的水平得分和垂直得分均明顯高于對(duì)照組，表明空瓶刺激后大鼠興奮性、敏感性增強(qiáng)，探究活動(dòng)增多，此結(jié)果與其他報(bào)道相似［10］，且給予空瓶情緒刺激的模型組出現(xiàn)了在陌生環(huán)境中的自主活動(dòng)和探究行為增多的表現(xiàn)，說(shuō)明在應(yīng)激后大鼠產(chǎn)生了情緒應(yīng)激反應(yīng)。

急性或長(zhǎng)期慢性心理刺激可以損傷VEC，這是導(dǎo)致心腦血管疾病的一個(gè)重要因素［11］。應(yīng)激反應(yīng)由于常反復(fù)啟動(dòng)內(nèi)皮損傷，引起血管舒縮因子分泌失衡，可最終導(dǎo)致心血管的病變［4］。VEC釋放血管舒張因子NO、PGI2，血管收縮因子ET-1、TXA2等調(diào)節(jié)血管的舒縮功能，從而維持基礎(chǔ)張力的穩(wěn)定［6］。Wallace等［12］研究證實(shí)，VEC損傷后，ET合成增多、NO合成和釋放減少，導(dǎo)致血管張力調(diào)節(jié)紊亂，內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，血管壁結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而引起血壓升高。VEC合成的另一對(duì)調(diào)節(jié)血管張力的細(xì)胞因子是TXA2和PGI2，TXA2和PGI2是作用相反的兩種前列腺素。TXA2由血小板釋放，可使血小板的聚集加重，及引起血管收縮;PGI2則相反，可防止血小板聚集及血管收縮，是一種血管擴(kuò)張劑［6］。二者在血液中不穩(wěn)定，檢測(cè)其代謝產(chǎn)物TXB2和6-Keto-PGF1α能較好地反映體內(nèi)兩者的水平。本研究顯示，模型組血漿 NO、6-Keto-PGF1α水平顯著降低，ET水平顯著升高，并且 NO/ET、6-Keto-PGF1α/TXB2值均降低，說(shuō)明心理應(yīng)激造成的內(nèi)皮損傷導(dǎo)致了血管的舒縮因子釋放失衡。

Adr是腎上腺髓質(zhì)分泌的主要激素，當(dāng)機(jī)體受到強(qiáng)烈刺激的時(shí)候，如興奮、恐懼、緊張等，機(jī)體出現(xiàn)以交感神經(jīng)興奮、兒茶酚胺分泌增加及下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)增多為主的一些列神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)，以適應(yīng)或?qū)勾碳?duì)機(jī)體的傷害。這樣的反應(yīng)對(duì)機(jī)體既有防御意義又有病理意義［13］。腎上腺髓質(zhì)適量的分泌Adr，可使機(jī)體呼吸加快，心跳與血液流動(dòng)加速，瞳孔放大，為身體活動(dòng)提供更多能量，使反應(yīng)更加快速。但是，激烈的應(yīng)激使垂體—腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)和交感—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)持續(xù)興奮，使血液中Adr的分泌增加并維持在較高水平，其強(qiáng)烈的縮血管作用可對(duì)血管的功能、結(jié)構(gòu)造成損傷［13］。同時(shí)，在應(yīng)激條件下，COR水平迅速升高，是應(yīng)激反應(yīng)中最重要的一種內(nèi)分泌活動(dòng)，其水平和持續(xù)時(shí)間與刺激強(qiáng)度有關(guān)，對(duì)機(jī)體抗損傷起重要作用，故COR的水平可作為反映應(yīng)激強(qiáng)度的指標(biāo)。有研究表明，在大量燒傷患者的休克期，血漿COR水平可以達(dá)到正常的3倍，經(jīng)治療后有所下降，但仍然高于正常［6］。在本研究中，空瓶刺激心理應(yīng)激模型組血漿Adr、COR水平比對(duì)照組明顯增高，這進(jìn)一步說(shuō)明大鼠在受到空瓶應(yīng)激后產(chǎn)生了情緒反應(yīng)及神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。

體內(nèi) Adr可在相關(guān)酶的作用下，脫氨生成H2O2、MA、FA等毒性代謝物，它們的生成如高于機(jī)體清除率，毒性物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)的時(shí)間延長(zhǎng)，能夠損害 VEC 組織結(jié)構(gòu)和功能［4．6］。臨床研究顯示，患有動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管病變者，其血漿FA濃度增高，同時(shí)伴有繼發(fā)性內(nèi)皮功能不全。FA和H2O2還可引起蛋白交聯(lián)、氧化應(yīng)激，進(jìn)而損傷內(nèi)皮［14］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組血漿中H2O2、MA、FA高于對(duì)照組。結(jié)合射電鏡觀察VEC的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，電鏡下對(duì)照組VEC的線粒體膜完整，嵴清晰，基底膜下無(wú)水腫，而模型組VEC的線粒體嵴模糊，部分線粒體出現(xiàn)空泡，基底膜下基質(zhì)增多，出現(xiàn)水腫。有研究結(jié)果表明，細(xì)胞對(duì)應(yīng)激原的反應(yīng)與應(yīng)激原的性質(zhì)、作用強(qiáng)度和細(xì)胞種類有關(guān)，如果刺激輕微以及時(shí)間短，則細(xì)胞可消除侵害，恢復(fù)到損傷前的狀態(tài)。如果刺激不致達(dá)到致死量，則細(xì)胞會(huì)通過(guò)改變其結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性做出改變，受累細(xì)胞出現(xiàn)可逆性損傷，表現(xiàn)出代謝、功能及形態(tài)異常等變化。在線粒體，應(yīng)激是引起其通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放，這可造成細(xì)胞內(nèi)膜的屏障功能破壞，使得小于1．5 kDa的任何分子可以自由穿過(guò)線粒體膜，而蛋白質(zhì)不能通過(guò)，因而導(dǎo)致其膠體滲透壓改變，造成線粒體腫脹。更嚴(yán)重的損傷則會(huì)是線粒體內(nèi)膜破壞，最終引起細(xì)胞的死亡［15］。透射電鏡的結(jié)果，也進(jìn)一步說(shuō)明空瓶刺激心理應(yīng)激引起了大鼠VEC損傷。

綜上所述，從血漿COR、NO水平變化以及VEC分泌的舒縮因子及掃描電鏡觀察可知，空瓶刺激心理應(yīng)激導(dǎo)致了大鼠VEC功能和結(jié)構(gòu)的損傷。該模型操作方便、周期短，是較理想的心理應(yīng)激性內(nèi)皮損傷動(dòng)物模型，能夠?yàn)樾睦響?yīng)激引發(fā)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展研究提供一種較好的模型。

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