槲皮素對過氧化氫誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

王志新，馬 釗，鄧同興，閆志勇，常 成，張勤安，高曉群＊

（1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 人體解剖教研室，河南 鄭州 450052；2.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 人體解剖教研室，河南 漯河 462002）

血管內(nèi)皮細(xì)胞是一層連續(xù)覆蓋整個(gè)血管腔表面的扁平細(xì)胞。它不僅具有屏障功能，而且有重要的內(nèi)分泌功能。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，其功能發(fā)生失調(diào)，會導(dǎo)致動脈粥樣硬化、腦缺血、高血壓、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生［1－2］。槲皮素（quercetin）是黃酮類化合物，廣泛存在于野生植物、蔬菜、水果和多種中草藥中。研究［3］表明，它具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑制血小板聚集等作用。我們采用過氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷作為體外模型，研究了槲皮素對過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為其應(yīng)用于心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

槲皮素（Sigma產(chǎn)品）；胰酶（Trypsin，北京沃德賽斯生物技術(shù)公司產(chǎn)品）；1640培養(yǎng)基（美國GIBCOBRL公司產(chǎn)品）；新生牛血清（美國GIBCOBRL 公司產(chǎn)品）；MDA、SOD 試劑盒（南京建成生物工程研究所產(chǎn)品）；其他常用無機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。Super T21離心機(jī)（美國科峻儀器公司）；Tj－6 離心機(jī)（美國Beckman公司）；MCO－15AC 二氧化碳培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）；DL－CJ－1N 高性能無菌實(shí)驗(yàn)臺（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；AIC UV－9100型紫外分光光度計(jì)（北京第二光學(xué)儀器廠）；XDS－1B 雙相倒置顯微鏡（重慶光電儀器總公司）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)［4］用戊巴比妥鈉將體質(zhì)量160～180g的雄性大鼠麻醉，取出胸主動脈，放入含有雙抗的體積分?jǐn)?shù)為20%小牛血清中，用眼科剪縱向剪開主動脈段，用眼科直鑷輕輕刮動內(nèi)膜，滴加3滴培養(yǎng)液于內(nèi)膜上，將含細(xì)胞的培養(yǎng)液加入預(yù)先鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶置二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2）。細(xì)胞融合后，呈鋪路石樣鑲嵌式單層排列，胰酶消化后進(jìn)行傳代。

1.2.2 槲皮素對過氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用［5］選取5代的內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞以5×104／mL的密度接種于96孔板中，每孔200μL，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿單層后，棄去上層培養(yǎng)液，用PBS 洗2次。實(shí)驗(yàn)分為正常細(xì)胞組、H2O2損傷組（150μmol／L）、給藥組（20、40、80μmol／L）。受試藥作用24h后，除正常細(xì)胞組外，其余各組每孔迅速加入預(yù)冷的H2O2溶液10μL，輕輕搖勻，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。3h 后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。用PBS 輕輕洗2次，每孔加入含0.5g／L MTT的無血清1640培養(yǎng)液100μL，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)4h 后，棄原培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200μL，搖床上振搖10min，用全自動酶標(biāo)儀測定570nm 處的吸光度（OD570nm），用于定量細(xì)胞存活率。參照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率%＝實(shí)驗(yàn)組OD570nm／正常組OD570nm×100%

1.2.3 槲皮素對損傷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中NO 含量的影響［6－7］將細(xì)胞以5×104／mL的密度接種于96孔板中，按上述條件處理，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。取培養(yǎng)液75 μL，再加75 μL的Griess 試劑，室溫放置15min，酶標(biāo)儀測定570nm 吸光度值。梯度NaNO2作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD570nm計(jì)算出NO 含量。

1.2.4 槲皮素對損傷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、SOD的影響［8－9］將細(xì)胞以5×104／mL的密度接種于24孔板中，按上述條件處理，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按試劑盒說明書測定培養(yǎng)液中MDA 含量、SOD 活力。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的影響

表1所示，正常細(xì)胞組的OD 值為0.58±0.04，終濃度為150μmol／L的H2O2作用3h后，OD 值降低為0.35±0.03，且細(xì)胞存活率明顯降低。與正常組相比有顯著性差異（P＜0.01），說明細(xì)胞損傷模型成功；與H2O2損傷組相比，終濃度為20、40、80μmol／L的槲皮素可以濃度依賴性升高OD570nm，將細(xì)胞存活率提高至（68.7±3.5）%、（75.8±3.6）%、（83.3±3.7）%，且與損傷組相比有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 槲皮素對H2O2損傷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中NO 含量的影響

表2所示，與正常細(xì)胞組相比，H2O2損傷組的NO 含量明顯降低（P＜0.01）；與H2O2損傷組相比，濃度為20、40、80μmol／L的槲皮素能濃度依賴性提高細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO 含量，且有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 槲皮素對H2O2損傷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含 量、SOD 活力的影響

表3 所示，與正常細(xì)胞組相比，終濃度為150μmol／L的H2O2作用3h后，MDA 含量明顯增加，說明細(xì)胞損傷模型成功；與H2O2損傷組相比，終濃度為20、40、80μmol／L的槲皮素可降低MDA 含量，且在濃度為40、80μmol／L時(shí)，與H2O2損傷組相比有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。與正常細(xì)胞組相比，終濃度為150μmol／L的H2O2作用3h后，SOD 活性明顯降低，說明細(xì)胞損傷模型成功；與H2O2損傷組相比，終濃度為20、40、80μmol／L的槲皮素可濃度依賴性升高SOD 活性；與H2O2損傷組相比有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 槲皮素對H2O2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的影響（n＝6）

表2 槲皮素對H2O2損傷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中NO 含量的影響（n＝6）

表3 槲皮素對H2O2損傷內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、SOD 活力的影響（n＝3）

3 討論

MTT 參與活細(xì)胞的能量代謝，可被活細(xì)胞線粒體腺苷三磷酸酶分解，形成藍(lán)紫色結(jié)晶物，而死細(xì)胞無此功能。該藍(lán)紫色結(jié)晶物能被DMSO 溶解，在570nm 處有一個(gè)較大吸收峰，在酶標(biāo)儀上可測定其吸收值（OD570nm）。該值可直接反映活細(xì)胞的數(shù)量和活性，OD570nm值降低表明活細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞活性下降［10］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使內(nèi)皮細(xì)胞的存活率明顯下降。 預(yù)先加入20～80μmol／L的槲皮素則可濃度依賴性地增加細(xì)胞存活率，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。NO 是血管內(nèi)皮衍生舒張因子，具有舒血管、抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等作用［11］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞在H2O2刺激下，NO 生成量明顯下降，和對照組相比有顯著性差異（P＜0.01）。加入槲皮素后，NO 生成量明顯升高，與H2O2組相比有顯著性差異。

MDA的含量反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度。我們采用硫代巴比妥法測定了H2O2損傷的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA的含量。結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞組相比，終濃度為150μmol／L的H2O2作用3h后，MDA 含量明顯增加。用槲皮素預(yù)處理后，則可不同程度地抑制由H2O2損傷引起的MDA 含量升高，說明槲皮素可通過抑制脂質(zhì)過氧化而減輕H2O2造成的細(xì)胞損傷。機(jī)體在正常情況下，存在完善的抗氧化體系，如SOD、CAT、GSH－Px等。其中SOD 是抗氧化體系的重要組成部分［12］，是機(jī)體內(nèi)清除自由基的第一線防衛(wèi)。主要清除超氧陰離子自由基，SOD 活性的高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞組相比，終濃度為150μmol／L的H2O2作用3h后，細(xì)胞SOD 活性明顯降低。說明H2O2處理細(xì)胞后，降低了細(xì)胞的抗氧化能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基增多，從而抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；而20～80μmol／L的槲皮素可顯著升高H2O2損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的SOD 活性，提示槲皮素通過增強(qiáng)細(xì)胞清除自由基的能力來保護(hù)細(xì)胞免受自由基誘發(fā)的氧化損傷。

我們的研究表明，過氧化氫可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。加入20～80μmol／L的槲皮素預(yù)處理后，可明顯保護(hù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞，其保護(hù)作用與促進(jìn)細(xì)胞釋放的NO、抑制脂質(zhì)過氧化以及清除氧自由基有關(guān)。

［1］Panza J A，Quyyumi A A，Brush J E Jr，et al.Abnormal endothelium－dependent vascular relaxation in patients with essential hypertension［J］.N Engl J Med，1990，323（1）：22－27.

［2］周穎，陳虹.血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂與心血管疾病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，6（8）：63－65.

［3］馬文強(qiáng)，馮杰，何軍豪.槲皮素的生物學(xué)效應(yīng)及應(yīng)用前景［J］.飼料工業(yè)，2007，28（8）：57－59.

［4］Centra M，Ratych R E，Cao G L，et al.Culture of bovine pulmonary artery endothelial cells on Gelfoam blocks［J］.FASEB J，1992，6（12）：3117－3121.

［5］何煜舟，丁美萍.大豆異黃酮對氧化損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.浙江中醫(yī)雜志，2006，41（4）：228－229.

［6］Wanchu A，Khullar M，Bhatnagar A，et al.Pentoxiphylline reduces nitric oxide production among patients with HIV infection［J］.Immunol Lett，2000，74（2）：121－125.

［7］Gross A，Spiesser S，Terraza A，et al.Expression and bactericidal activity of nitric oxide synthase in Brucella suis－infected murine macrophages［J］.Infect Immun，1998，66（4）：1309－1316.

［8］彭亮，李知敏.紫萍提取物對過氧化氫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（4）：996－998.

［9］Gong G，Qin Y，Huang W，et al.Protective effects of diosgenin in the hyperlipidemic rat model and in human vascular endothelial cells against hydrogen peroxide－induced apoptosis［J］.Chem Biol Interact，2010，184（3）：366－375.

［10］Sladowski D，Steer S J，Clothier R H.An improved MTT assay［J］.Immunol Methods，1993，157（1－2）：203－207.

［11］Amal J F，Dinh－Xuan A T，Pueyo M，et al.Enclothelium devived nitric oxide and vascular physiology and pathology［J］.Cell Mol life Sci，1999，55（8－9）：1078－1087.

［12］Pellegrini－Giampietro D E，Cherici G，Alesiani M，et al.Excitatory amino acid release and free radical formation may cooperate in the genesis of ischemia－induced neuronal damage［J］.J Neurosci，1990，10（3）：1035－1041.